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来源：中国科技大学生命科学实验中心
本文由生.物.秀根据“中国科技大学生命科学实验中心”的PPT课件整理，仅供大家学习参考。
流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。
流式细胞仪的特点
1.单个细胞分析
2.同时多参数分析
3.速度快：10000个细胞/秒
4.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况
5.分选感兴趣的细胞
•流式细胞仪的原理
-流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选
-研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等
-研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量
流式细胞仪仪器结构
-液流系统
-光学系统
激光光源
光收集系统
-电子系统
光电转换
数据处理系统
细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细 胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性 蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能 够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波 振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。
荧光染料及其发射波长
FITC 525nm
PE 575nm
PI 630nm
自发荧光与特异荧光
抗体的选择
首选直接标记抗体
荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：一般不提倡用
实验对照的设计
空白对照：ALL
阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照
多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
阳性对照：检测阴性时
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化
抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应
非特异结合的去除：洗涤和封闭
封闭：血清和同型抗体
流式细胞仪的样品要求
单细胞悬液
被检细胞或颗粒大小0.2－80um
样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升
流式细胞仪的光学系统
-激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照
-激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。
-光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器
流式细胞仪的光学系统
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
1 流式细胞仪的散射光信号
FSC:表示细胞大小
SSC：表示细胞内颗粒的复杂程度
外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）
2，荧光信号
-荧光素吸收激光能量
-荧光素将吸收能量释放，转换为：
振动能和热能
释放较入射光波长更长的光量子
-荧光素与特异抗体结合
-荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析
-当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号
-荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度
-电脉冲信号经A/D转换成数字信号
-数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
细胞分选的原理
当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器(interference detector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。
流式细胞仪分选系统
流式细胞仪的应用
流式细胞仪的科研应用
细胞表型分析
胞内细胞因子的检测
染色体分类研究
细胞周期和DNA倍体分析
流式标准小球定量
分选
细胞内钙离子测量
How to analyze soluble proteins in FCM?
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