作者：何海辉 来源：中科大生命试验中心
内 容
荧光光谱基础；
蛋白质的荧光特性；
荧光分光光度计的结构和原理。
吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图
（一）荧光的产生
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
可以引起发射荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率
荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。
（三）荧光的猝灭
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭 ，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需要的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。
物质的荧光激发光谱和发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。
荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。
蛋白质内源荧光
蛋白质在270-300nm有吸收，这种吸收主要来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，所以蛋白质具有天然荧光。当用280nm波长激发时，蛋白质大致有相同的荧光光谱，最大值在313nm和350nm处。前者恰与酪氨酸一致，后者恰与色氨酸一致，没有色氨酸的组蛋白只给出最大在313nm的荧光光谱，没有芳香族氨基酸的蛋白质不显示荧光。
应用
荧光分光光度计通过测定样品经激发后发射出的荧光进行定性或定量分析。荧光定量分析法灵敏度高、选择性好，已广泛运用于地质、冶金、化工、环保、生物、食品、化学等领域，可对维生素、蛋白质、药物、农药及无机物进行定量分析和荧光光谱的测定。
仪器
1.RF-5301PC型荧光分光光度计
实现世界最高水平的S/N比，达150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。提供丰富的数据处理、显示功能。
2.AMINCO-Bowman® Series 2型荧光分光光度计
单色器
单色器均为Seya-Namioka设计，采用凹面全息光栅和为数极少的反射镜。既简单又耐用，不需要现场校准。计算机驱动光栅，控制狭缝，既准确(+/- 0.1nm)、又快(12000nm/min)，可靠性高。
检测器
采用光电倍增管检测器。PMT有两种工作模式：a. 模拟――高灵敏度，宽动态范围，操作方便；b.光子计数――提供极高的灵敏度, 联结式盖锁可保护PMT。
技术特点
1. 时间分辨技术
时间分辨发光光谱技术是基于不同发光 体的发光衰减速率的不同进行组分的分辨和分别测定的技术。
2 .偏振和各向异性技术
在偏振光激发下，荧光体所发射的荧光在空间不同取向强度不同，即偏振光。此技术在生化领域中有广泛的应用，如生物分子间的缔合反映，抗体或抗原的测定等。
3. 同步扫描技术
同步扫描技术可分为固定波长差、固定能量差和可变波长同步扫描，具有使光谱简化，提高选择性，减少影响等特点。
4. 三维光谱
三维光谱技术能获得激发波长和发射波长同时变化的光强度信息，有等高线图和三维投影图两种形式。三维光谱技术能获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术。
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