[转发]PCR-SSCP原理改进及应用

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是pCR技术问 世以后，各种与pCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 pCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length polymorphism，RFLp)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的pCR-SSCp(下文称SSCp)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测pCR诊断实验中的交*污 染情况，以及传染源的调查等.由于SSCp的突出的优点，近几年被大量地应用.

一、SSCp的原理及特点

　　日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(pAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation polymorphism，SSCp)分析.在随后的研究中，作者又 将SSCp用于检查pCR扩增产物的基因突变，从而建立了pCR-SSCp技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①pCR扩增靶DNA;②将特异的pCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由 于SSCp是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变.Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCp发 现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCp方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.

二、SSCp的不断改进

　　SSCp技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入pCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与pCR-SSCp结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCp值得注意的改进是将DNA-SSCp分析，改为RNA-SSCp分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.

　　为了进一步提高SSCp的检出率，可将SSCp分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂 交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用 探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性pAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCp和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.

三、pCR-SSCp的实验操作

　　在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DNA片段长度(核苷酸数)	(%)
1Kb～700b	3.5
700b～500b	5
500b～200b	8
200b	12

　　在进行SSCp前首先要通过pCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

　　1)制备聚丙烯酰胺凝胶(pAG)

　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用.

　　2)电泳

　　取10μlpCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

　　3)银染法

　　将pAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.

四、SSCp的应用

　　自从Orita等用SSCp进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCp法，成功地检测 了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCp还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCp法检测了28名b 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCp和直接基因测序法进行了比 较，发现在全长2.6kbp的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCp可检测 出其中的70%，而DNA-SSCp只能检测出35%，显示了RNA-SSCp比DNA-SSCp有更高的灵敏 性.

SSCp法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测pCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中.Yap用巢式pCR对来自不同国家和地区的HbV标品 进行了检测，并对扩增产物进行了SSCp分析，发现每个标本的SSCp图谱完全不同，不 仅证明了HbVDNA具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证pCR诊断 结果的可靠性找到了好方法.另外，Yap等还将SSCp用于DNA定量分析上，他们将SSCp 与竞争性pCR法相结合进行乳腺癌细胞突变p53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同 的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCp正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用.

五、SSCp注意的事项

　　SSCp是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCp达到最佳效果，应 注意下列事项.

　　①重复性.影响SSCp重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变， SSCp图谱可保持良好的重复性.一般SSCp图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 立体构象.有时三条以上的SSCp图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.

　　②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCp对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCp 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.

　　③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCp应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度 升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCp时，开始的5min应用较 高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.

　　④DNA片段中点突变的位置对SSCp的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCp检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链 上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCp检测出来).White曾 设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现SSCp只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明 DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.

　　⑤SSCp的结果断定:由于在SSCp分析中非变性pAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判 定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无 变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有 改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCp 分析中其它条件，如pCR产物的上样量，pAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.总之，SSCp分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法， 适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着 SSCp分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具.