[转发]ELISA中非特异性显色原因分析

作者：张建伟 来源：《临床输血与检验》

【摘要】：影响ELISA中非特异性显色的原因很多，如试剂盒特异性、检验标本中含酶标记物的干扰物，操作过程中的问题。本文就这一原因作一简要分析,以便可以通过以上措施把非特异显色降至最低限度，从而提高检测的特异性，并得到更准确、可靠的实验结果。
【关键词】 ELISA 非特异性 显色
酶联免疫吸附试验（ELISA）自1971年自问世以来，以其敏感性高，特异性强，操作简便、安全，而广泛应用于临床诊断，开创了免疫学诊断的新纪元。但同其它免疫诊断方法一样酶免试剂在它的研究、生产及使用中常常会碰到非特异性问题，本文就在实验过程中产生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特异性显色作一分析。
1、试剂盒特异性因素
1、1 固相载体的选择。ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种，以微量滴定板最为常见[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各产品的质量差异很大。因此，在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证，评估。
1、2包被物的纯度。在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中，试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。目前由于技术条件的限制，包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%，所以有些非特异性显色不可避免，只能尽可能提高纯度，提高特异性。目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原。
1、3包被抗体的效价。具有高亲和力和高特异性的包被抗体，是决定试剂特异性的重要方面。
1、4 封闭。是ELISA中重要的一步，目的是封闭固相载体表面尚未被所占据的空隙[2]，减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。
2、检验标本中含有酶标记物的干扰物
2、1内源性干扰物：类风湿因子（RF）、黄疸等，类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应，从而呈现非特异性显色。
黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用辣根过氧化物酶为标记物，就有可能产生非特异性显色。
2、2 外源性干扰物，常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。溶血标本，红细胞溶解破裂，释放出血红素形成，而血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP（辣根过氧化酶）[2]，有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性[3]。如在冰箱中保存过久，其中的IgG可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血标本在采集处理时应小心，在冰箱中保存不易过久。
标本凝集不全时，血清中会残留部分纤维蛋白原，也易造成假阳性。
3、操作过程中的问题造成假阳性
3、1加样
对于间接ELISA标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的绝对误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。
3、2洗涤
在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
3、3 温育
每种试剂都有其最佳反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。
3、4酶标仪判读
作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，最好使用双波长，一个检测波长，一个参比波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外，在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书
综上所述，由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清（血清盘）。但由于受方法学及技术条件的限制，在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性，但我们可以通过以上措施把非特异性显色降至最低限底，从而提高检测的特异性，并得到更准确、可靠的实验结果。

参考文献
[1] 王培华，主编.输血技术学[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1998.84.
[2] 郑怀充，韩松，主编.临床检验.ELISA指南[M].北京:北京医科大学、北京协和医科大学联合出版社，1994.40.
[3] 刘振玉，张淑琴，马宏伟，等.溶血对抗—HIV、HBsAg等测定结果的影响[J].中国输血杂志，1999，12（1）：32.

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