注册登录才能更好的浏览或提问。
您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?立即注册
×
一.卵白素和生物素免疫组织化学染色 1.标记卵白素—生物素(LAB)技术 (1)石蜡切片常规脱腊入水。 (2)0.3%H2O2—甲醇10分钟,水洗。 (3)PBS洗3次。 (4)加生物素(Biotin)标记的特异性一抗,37。C30分钟,置湿盒内。 (5)PBS洗3次。 (6)加酶标记的卵白素(Avidin), 37。C30分钟。 (7)PBS洗3次。 (8)DAB显色。 (9)流水冲洗,复染、脱水、封片。 2.桥式卵白素-生物素(BRAB)技术 (1)同LAB技术(1)--(5) (2)加卵白素(Acidin)37。C30分钟。 (3)PBS洗3次。 (4)加酶标记的生物素(Biotin), 37。C30分钟。 (5)同LAB技术(7)--(9) 3.卵白素—生物素---过氧化物酶复合物(ABC)技术(三步法) (1)同LAB技术(1)--(2) (2)必要时胰酶消化,37。C30分钟。 (3)蒸馏水洗,PBS洗2次。 (4)正常羊血清(1:5-10)室温,10-20分钟。 (5)特异性抗体适当稀释,置湿盒中37。C60分钟或4。C过夜。 (6)PBS洗3次。 (7)生物素化(Biotin)第二抗体,37。C20分钟。 (8)PBS洗3次。 (9)ABC试剂,37。C30分钟,置湿盒中。 临用前将试剂A与试剂B等量混合,稀释为1:100的浓度,滴加于切片上。 (10)PBS洗3次。 (11)同LAB技术(7)--(9) 4.ABC快速法 在大量标本染色或快速切片的免疫组化染色时,可采用ABC快速染色法。 (1)同LAB技术(1)--(3) (2)PBS洗3次。 (3)用含4%BSA和1%正常血清的PBS作用2分钟。 (4)特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液孵育15分钟。 (5)PBS洗3次。 (6)同LAB技术(8)--(9) 特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液的配制:于染色前30分钟用等体积的生物素化IgG—ABC混合,然后加入经适当稀释的特异性抗体。 5.PAP—ABC(ABPAP)技术 将PAP技术和ABC技术两者结合起来,连续应用,可提高敏感性。染色程序: (1)切片脱腊入水。 (2)0.3%H2O2—甲醇10分钟,水洗。 (3)0.1% 胰酶消化37。C10--20分钟。 (4)PBS洗3次。 (5)与二抗相同的正常血清1:10,室温10分钟。 (6)滴加适当稀释的特异性抗体,4。C过夜,37。C复温30分钟。 (7)PBS洗3次。 (8)滴加桥抗体(如马抗鼠或氧抗兔IgG,1:200—400),37。C30分钟。 (9)PBS洗3次。 (10)滴加鼠PAP或兔PAP,1:200—500,37。C40分钟。 (11)PBS洗3次。 (12)生物素化IgG(如马抗鼠或氧抗兔)37。C20分钟。 (13)PBS洗3次。 (14)ABC复合物37。C40分钟。 (15)PBS洗3次。 (16)DAB显色,冲洗,复染、脱水、封片,观察。 二.葡萄球菌A蛋白免疫染色 1.SPA—HRP间接法 (1) 同LAB技术(1)--(3) (2) 用TBS(PH7.6)洗3次。 (3) 滴加特异性抗体37。C60分钟,或4。C过夜。 (4) TBS洗3次。 (5) 滴加SPA—HRP(1:100—400)37。C30分钟。 (6) TBS洗3次。 (7) DAB显色。 (8) 流水冲洗,复染、脱水、封片。 1.SPA—HRP用于PAP法 (1) 切片脱腊至水洗 (2) 80%甲醇—0.6%H2O2封闭内源性酶5分钟。 (3) 10%卵白素Tris缓冲液洗,20分钟。 (4) 特异性抗体37。C30--60分钟,或4。C过夜。 (5) TBS(PH7.6)洗3次。 (6) SPA(1ug/ml)5分钟。 (7) TBS洗3次。 (8) PAP复合物(无种属限制)5分钟。 (9) TBS洗3次。 (10)DAB-- H2O2显色。Mayer’s苏木素淡染。脱水、透明、封片、镜检。 三.凝集素受体的检测步骤: (1) 石蜡切片脱腊入水 (2) PBS洗3次 (3) 0.05%胰蛋白酶消化37。C,20分钟 (4) PBS洗3次 (5) 小鼠肝粉溶液(100ug/ml)或用1%BSA30分钟 (6) 生物素化凝集素37。C,60分钟 (7) PBS洗3次 (8) ABC试剂37。C40分钟 (9) PBS洗3次 (10)DAB显色,复染、常规封片 注意事项: (1)市售凝集试剂,均为生物素标记,美国Vector公司生产的生物素植物凝集素有10种以上,在检测凝集素受体时,生物素化凝集素要进行适当稀释,以获得较好的显色效果。 (2)生物素化的凝集素需要用ABC或Avidin金标记抗体显示,才能检测出相应的受体,故ABC或Avidin金标记抗体也应有生物素化的凝集素相适应的稀释度,这也是保证显色效果的关键。
|