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[转发]亲和免疫组织化学技术的染色步骤

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郑振寰 发表于 2007-6-5 14:48 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一.卵白素和生物素免疫组织化学染色
1.标记卵白素—生物素(LAB)技术
(1)石蜡切片常规脱腊入水。
(2)0.3%H2O2—甲醇10分钟,水洗。
(3)PBS洗3次。
(4)加生物素(Biotin)标记的特异性一抗,37。C30分钟,置湿盒内。
(5)PBS洗3次。
(6)加酶标记的卵白素(Avidin), 37。C30分钟。
(7)PBS洗3次。
(8)DAB显色。
(9)流水冲洗,复染、脱水、封片。
2.桥式卵白素-生物素(BRAB)技术
(1)同LAB技术(1)--(5)
(2)加卵白素(Acidin)37。C30分钟。
(3)PBS洗3次。
(4)加酶标记的生物素(Biotin), 37。C30分钟。
(5)同LAB技术(7)--(9)
3.卵白素—生物素---过氧化物酶复合物(ABC)技术(三步法)
(1)同LAB技术(1)--(2)
(2)必要时胰酶消化,37。C30分钟。
(3)蒸馏水洗,PBS洗2次。
(4)正常羊血清(1:5-10)室温,10-20分钟。
(5)特异性抗体适当稀释,置湿盒中37。C60分钟或4。C过夜。
(6)PBS洗3次。
(7)生物素化(Biotin)第二抗体,37。C20分钟。
(8)PBS洗3次。
(9)ABC试剂,37。C30分钟,置湿盒中。
临用前将试剂A与试剂B等量混合,稀释为1:100的浓度,滴加于切片上。
(10)PBS洗3次。
(11)同LAB技术(7)--(9)
4.ABC快速法
在大量标本染色或快速切片的免疫组化染色时,可采用ABC快速染色法。
(1)同LAB技术(1)--(3)
(2)PBS洗3次。
(3)用含4%BSA和1%正常血清的PBS作用2分钟。
(4)特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液孵育15分钟。
(5)PBS洗3次。
(6)同LAB技术(8)--(9)
特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液的配制:于染色前30分钟用等体积的生物素化IgG—ABC混合,然后加入经适当稀释的特异性抗体。
5.PAP—ABC(ABPAP)技术
将PAP技术和ABC技术两者结合起来,连续应用,可提高敏感性。染色程序:
(1)切片脱腊入水。
(2)0.3%H2O2—甲醇10分钟,水洗。
(3)0.1% 胰酶消化37。C10--20分钟。
(4)PBS洗3次。
(5)与二抗相同的正常血清1:10,室温10分钟。
(6)滴加适当稀释的特异性抗体,4。C过夜,37。C复温30分钟。
(7)PBS洗3次。
(8)滴加桥抗体(如马抗鼠或氧抗兔IgG,1:200—400),37。C30分钟。
(9)PBS洗3次。
(10)滴加鼠PAP或兔PAP,1:200—500,37。C40分钟。
(11)PBS洗3次。
(12)生物素化IgG(如马抗鼠或氧抗兔)37。C20分钟。
(13)PBS洗3次。
(14)ABC复合物37。C40分钟。
(15)PBS洗3次。
(16)DAB显色,冲洗,复染、脱水、封片,观察。
二.葡萄球菌A蛋白免疫染色
1.SPA—HRP间接法
(1) 同LAB技术(1)--(3)
(2) 用TBS(PH7.6)洗3次。
(3) 滴加特异性抗体37。C60分钟,或4。C过夜。
(4) TBS洗3次。
(5) 滴加SPA—HRP(1:100—400)37。C30分钟。
(6) TBS洗3次。
(7) DAB显色。
(8) 流水冲洗,复染、脱水、封片。
1.SPA—HRP用于PAP法
(1) 切片脱腊至水洗
(2) 80%甲醇—0.6%H2O2封闭内源性酶5分钟。
(3) 10%卵白素Tris缓冲液洗,20分钟。
(4) 特异性抗体37。C30--60分钟,或4。C过夜。
(5) TBS(PH7.6)洗3次。
(6) SPA(1ug/ml)5分钟。
(7) TBS洗3次。
(8) PAP复合物(无种属限制)5分钟。
(9) TBS洗3次。
(10)DAB-- H2O2显色。Mayer’s苏木素淡染。脱水、透明、封片、镜检。
三.凝集素受体的检测步骤:
(1) 石蜡切片脱腊入水
(2) PBS洗3次
(3) 0.05%胰蛋白酶消化37。C,20分钟
(4) PBS洗3次
(5) 小鼠肝粉溶液(100ug/ml)或用1%BSA30分钟
(6) 生物素化凝集素37。C,60分钟
(7) PBS洗3次
(8) ABC试剂37。C40分钟
(9) PBS洗3次
(10)DAB显色,复染、常规封片
注意事项:
(1)市售凝集试剂,均为生物素标记,美国Vector公司生产的生物素植物凝集素有10种以上,在检测凝集素受体时,生物素化凝集素要进行适当稀释,以获得较好的显色效果。
(2)生物素化的凝集素需要用ABC或Avidin金标记抗体显示,才能检测出相应的受体,故ABC或Avidin金标记抗体也应有生物素化的凝集素相适应的稀释度,这也是保证显色效果的关键。

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