[转发]亲和免疫组织化学技术的基本原理

一、卵蛋白和生物素免疫染色
很早以前，人们就注意到给动物喂饲大量鸡蛋白时，可引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白质，分子量约为68，000，属于糖蛋白一类。当时命名为卵白素（Avidin）。卵白素具有4个由128个氨基酸组成的相同亚基，与生物素（又称维生素H）以及其他物质（例如荧光素和酶）具有很高的亲和力。当动物被饲以大量鸡蛋白时，由于卵白素将大量的维生素H结合所致动物出现维生素缺乏。卵白素在一般条件下性质稳定，可耐受80 oC两分钟而仍保持其活性，当与生物素结合形成复合物后，性质就更稳定，可在很大的PH范围内以及对许多蛋白酶都有耐受能力。
生物素（维生素H，Biotin）是Kögl等（1936）首先从鸡蛋黄中分离出来的。它还广泛地分布于动、植物组织中，并以辅酶的形式参与各种羟化酶反应。生物素为一种较小分子量的维生素，其分子量约为244，它与卵白素之间具有高度极强的亲和力，较之抗原与抗体的亲和力高出100万倍，能够彼此牢固地结合而不影响彼此的生物学活性。
由于卵白素和亲和素之间具有高度的亲和性，生物素可与抗体偶联，不论生物素还是卵白素均能与酶（过氧化物）结合并不影响酶的活性，这样就将亲和化学和免疫细胞化学结合起来而形成卵白素-生物素免疫染色技术。
卵白素和生物素用语免疫细胞化学标记技术只要有以下几种形式。
1.标记卵白素-生物素（Labeled avidinbiotin, LAB）技术，是将活化的生物素（即利用生物素的羧基加以化学修饰后的可制成各种基团的衍生物）和免疫球蛋白等共价偶联后，加入与荧光或过氧化物酶结合的卵白素，利用生物素和卵白素的亲和结合，显示生物素欧联的物质（即抗原）。
2．桥式卵白素---生物素（bridged avidin biotin BRAB）技术，是利用卵白素作为桥梁，连接生物素偶联物质和生物素化的过氧化酶，而显示于生物素偶联的物质。
上述两种方法均须以生物素标记第一抗体（即特异性抗体），应用有一定的困难和局限。
3.卵白素—生物素---过氧化物酶复合物（Avidin-biotin peroxidase complex, ABC）技术，该技术是由1981年Hsu等在LAB和BRAB的基础上，改良进行建立的。现将卵白素和生物素偶联的过氧化物酶按一定的比例组合成卵白素—生物素---过氧化物酶复合物，从而保证卵白素有一定的游离结合点让生物素偶联物质结合。由于一个卵白素分子具有可与生物素结合的4各位点，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶结合，另一部分具有可与生物素标记的免疫球蛋白反应，生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白可以结合多个生物素分子，从而增强了免疫球蛋白或过氧化物酶结合卵白素的能力，这样卵白素就可作为桥梁，把生物素抗体结合物及生物素酶结合物连接起来进有可能偶合更多的酶分子，并且这种相互作用的连接能形成一种较大的类似晶体的复合物，从而大大提高了酶染色的灵敏度。
因此，ABC技术具有以下优势：
（1） 敏感性强。Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现其敏感性较PAP发高20—40倍，能显示PAP法所不能显示的抗原。
（2） 特异性强。由于敏感性提高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能高的浓度，减少了非特异性染色，背景淡。
（3） 方法简便。由于脸白素和生物素间的极高亲和能力，使得结合时间可明显缩短，符合物的制备是操作简便。
（4） 由于生物素和卵白素具有和多种示踪物高度亲和的能力，可用于双重或多重免疫染色。
二、葡萄球菌A蛋白免疫染色
葡萄球菌A蛋白（staaphylococal protein A,SPA）是一种从金黄色葡萄球菌壁上分离的蛋白质。早在1940年，Verwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散实验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1952）也发现了类似现象，并将其命名为A抗原。其后分离并证明了这种物质是一种蛋白质，为了与A多糖相区别，Crov（1960）将其命名为葡萄球菌A蛋白，简称SPA或蛋白A。由于SPA的一些免疫特性，引起了很多免疫学家的兴趣，并迅速发展成为免疫学上一种极为有用的工具。
SPA存在于大多数（90%）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中，SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子是一个单链多肽，由亮、颉、脯、丙、苏、甘、丝、谷、赖和门冬氨酸等10种氨基酸组成，整个分子不含胱氨酸合半胱氨酸，故部含二硫键。分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸消化细胞壁后超速离心或用加热抽提法，所测分子量为12，000—15，000。用沉淀平衡分析和在6M鸟嘌呤盐酸盐重凝胶过滤，测出分子为42，000。SPA的粘度高于球蛋白，等电电为PH5.1，其天然结构十分文，即使用尿素、硫氰酸盐和酸等处理也不影响其活性。
SPA的单链多肽分子上，含3个高度相似的Fc段结合量区，每区由50个以上氨基酸组成。能与任何多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc段结合，能起反应的哺乳动物包括豚鼠、小鼠（纯种）、狗、猪、猴和经免疫的家兔。一般而言，SPA只与人的IgG₁,、IgG₂和IgG₄结合，结合部位经证实为CH₂和CH₃交界处。人血清中少数IgA和IgM也可与SPA反应。
SPA与IgG结合的部位是Fc段而不是Fab段，这样就不会影响抗体的活性。同时，SPA的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面与IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。而且结合后并不影响上述物质的活性。SPA的这一特性，使其成为抗体和标记物之间的纽带，充当了亲和细胞化学与免疫细胞化学相结合的又一重要角色。
SPA在免疫组织化学重的主要作用有：
1. 标记SPA定位组织内的IgG 由于SPA能与IgG Fc段结合，因此就成为天然的抗IgG。用荧光素或酶标记的SPA可代替荧光素或酶标记的IgG抗血清，直接检测定位组织的内IgG和免疫物。
2. 标记SPA替代第二抗体 利用SPA与多种IgG分子Fc段的高度亲和结合的能力，可用标记的SPA替代的二抗体。由于器具由于多种动物抗血清反应的能力，则不需因不同种属动物而制备相应的第二抗体（即桥抗体）。同时由于SPA 与Fc段的高度亲和力，可高度稀释SPA，减少非特异性背景着色。
3. 作为桥抗体用于PAP法 SPA作为桥抗体的最大优点是不受种属特异性的限制，SPA不仅能与多种动物的第一抗体反应，也能与不同的PAP复合物反应，这样，当特异性一抗为鼠源性，利用SPA的特点，可连接上兔源性的PAP复合物，而不必只能连接鼠源性PAP复合物，是应用的范围明显拓宽了。此外，由于SPA与Fc段的结合是亲和反应，而不是抗原抗体的免疫反应，因而反应的速度极为迅速，大大减少了实验时间，降低了实验的难度。
4. 用于双标记技术 SPA可与其他免疫组织化学技术相结合而用于双标记技术，从而同时检测组织中的两种抗原。
5. 用于免疫电镜 应用SPA与胶体金和铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。
三、凝集素免疫染色
凝集素（Lectins）是指一种从各种植物、无脊柱动物和角高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如刀豆素A(conconvalina, conA), 麦芽素（wheat germ agglutintin,WGA）,植物凝集素（phytonomagglutin,PHA）,花生凝集素（peanut agglutinin PNA）,黄豆素（soybean agglutinin,SBA）,荆豆素(Ulex europeaus agglutinin,UEA)等，凝集素是他们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，但却具有某些亲和特性，能被免疫胞化学技术所应用。
大多数植物凝集素是多聚体，由非共价键缔结的亚单位所组成，能识别糖蛋白和糖肽中特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即席薄膜表面的碳水化合物决定族。一种凝集素具有只队某一种特异性糖基专一性结合的能力，它于是别的糖以非共价键结合，在细胞表面与糖分子连接，因而在细胞间形成“桥”而使细胞凝聚。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。此外，凝集素也具有多家结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，在光镜或电镜下显示免疫反应的部位。
凝集素的应用：
凝集素的生物学作用涉及多种生理功能。作为一种研究工具应用于多个领域，如刺激细胞分裂、细胞分离，生物膜结构和功能等。作为一种分子探针，对细胞的分化，细胞间的连接，肿瘤细胞的生物学行为等具有重要的标记意义。