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电化学发光(ECL)在药物和生化分析中的应用 王 鹏 张文艳 周 泓 朱果逸
(中国科学院长春应用化学研究所电分析化学开放研究实验室,
国家电化学和光谱研究分析中心 长春 130022) 1929年，Harvey在电解碱性鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)水溶液时发现电极附近有发光现象。60年代以后，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)的研究有了很大的进展。国内外都有人对此进行评述［1～5］，Bard［6～10］小组在这个领域有突出的贡献。ECL分析是将电化学手段和化学发光方法相结合的一种技术，从而弥补了化学发光法的不足，如重现性和灵敏度进一步提高，在多种组分同时存在时，可施加不同波形、不同电压的信号进行选择性测量。近年来，ECL技术已广泛应用于氨基酸、药物、抗氧剂等生化物质的测定，特别是最近IGEN和Boehringer Mannheim等公司合作把其应用于免疫分析、聚合酶链转录(PCR)产物的测定和基因序列研究，使ECL的研究进入一个高潮时期［11～15］。
1 ECL的基本原理
ECL分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组分进行化学发光，通过测量发光光谱和强度来测定物质含量的一种痕量分析方法。鲁米诺的ECL行为以及影响ECL的各种因素已有报道［16］。Leland［17］对三联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)的ECL机理进行了广泛深入的研究。能进行ECL的物质很多，但目前用于药物 和生化分析的多为Ru(bpy)2+3体系，因而这里就以 Ru(bpy)2+3-三丙胺(TPA)为例说明ECL的基本原理。如图1所示，Ru(bpy)2+3和TPA分别在阳极表面氧化成Ru(bpy)3+3和三丙胺的阳离子自由基(TPA+*)，TPA+*迅速脱去1个 质子形成三丙胺自由基(TPA·)，TPA·具有强的还原性，从而把 Ru(bpy)3+3还原为激发态的Ru(bpy)2+*3，后者发射1个620 nm的光子回到基态再参与下一次ECL。只需0.01 ms就可发出稳定的光，每毫秒几十万次的循环ECL大大提高了分析的灵敏度。另外，通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂Ru(bpy)3+3和TPA·，避免了直接使用Ru(bpy)3+3对分析测试的影响。
2 ECL在药物分析中的应用
Greenway［18］小组把硅光 二极管用作流动注射电化学发光(FIA-ECL)分析的检测器 ，并建立了Ru(bpy)2+3和TPA进行ECL的测定方法，检测限达10－9 g/mL，动力学范围为3个数量级。这种方法已被用于选择性地测定β-肾上腺功能药物氧烯洛尔(oxprenolol)，线性范围为0.0001～0.04 m mol/L，检测限为35 n mol/L［19］。他们还建立了局麻药丁卡因、布比卡因、利多卡因、丙胺卡因和普鲁卡因的ECL测定方法［20］。抗抑郁药阿米替林的ECL测定也被报道［21］。他们还用ECL方法测定了具有麻醉作用的药物可待因、海洛因和具有镇咳作用的药物右美沙芬。并发现4-乙酰氨基酚等含有酚官能团的物质能够影响Ru(bpy)2+3的ECL，从而推测吗啡不具有ECL活性的原因是其所含酚官能团对ECL有一定猝灭作用，并指出若通过一个简单的方法把吗啡修饰为3-乙酰吗啡，可实现吗啡的间接测定［22］。他们还对这类药物的结构和ECL性能之间的关系进行了研究［4］，这样不但较好地解释了不同药物不同的ECL性能，并且可以预见药物通过这种方法进行测定的可能性和灵敏度。
Liang［23］等先用β-内酰胺酶水解打开β-内酰胺环，然后用ECL的方法间接测定了10种含有该环的抗生素药物。有趣的是当他们把其中的胺比西林(ampicillin)和6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid)与带有手臂的Ru(bpy)2+3形成酰胺键后，继而用β-内酰胺酶水解进行ECL测定，发现灵敏度提高了125倍［24］。本体系这种分子内不同活性部位相互作用进行ECL的机理尚未被清楚认识，我们正在通过分子设计和合成来探讨此机理。ECL还被用于红霉素和磷酸克林霉素的测定。ECL还被用于液相色谱的柱后检测来测定非尼拉敏(pheniramine)、溴苯那敏(brompheniramine)、苯海拉明、氯苯那敏(chlorpheniramine)和美吡拉敏(mepyramine)等抗组胺药。另外，把ECL和流动注射技术结合来测定痕量的氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、环噻嗪(cyclothiazide)和氯噻嗪等利尿降压药也被报道［27］。
3 ECL在免疫分析中的应用
免疫分析是临床检验的一种重要技术，ECL在此充分体现了其非放射性标记、快速、灵敏、动力学范围宽的优点。利用竞争和双抗体夹心免疫电化学发光(IECL)测定促黄体激素(LH)、牛血清IgG、牛血清生长激素、胰岛素样生长因子(IGF-1)和鲑甲状腺降钙素已被报道［12］。人绒毛膜促性腺激素(HCG) 、前列腺特异性抗原(PSA)和促甲状腺激素(TSH)可用双抗夹心IECL测定， 地高辛、雌二醇和游离甲状腺素(FT4)可用竞争IECL测定［13,14,22］。 IGEN公司还把此技术用于肌钙蛋白［29］、胰岛素、甲胎蛋白(AFP)、促卵泡激素(FSH)、癌胚抗原(CEA)［30］等对生命活动有重要意义的物质的测定。肿瘤坏死因子(TNF)是能引起肿瘤组织出血性坏死的一类细胞因子。Moreau［31］发现可溶性肿瘤坏死因子受体sTNF-R55和sTNF-R75对TNF-α的IECL测定有很大的影响，并指出延长温育时间和提高俘获抗体的浓度将有利于减小干扰。ECL还可用于T细胞的γ-干扰素(IFN-γ)水平的定量测定［32］。Boehringer Mannheim公司已把IECL技术用于人体肿瘤相关糖蛋白的测定［33］。另外，IECL还可用于白细胞介素(IL)的测定，如IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、I L-8、IL-10等［34］。Yasuo［35］等建立了鲁米诺-过氧化氢体系的IECL分析方法，并把它用于人免疫球蛋白(HIgG)、人血清白蛋白(HSA)、人中性粒细胞溶菌酶(HNL)的测定。IECL还被用于抗人IgG、兔抗鼠IgG等抗体和牛血清白蛋白(BSA)的测定［36］。Gatto-Menking［37］用IECL技术对肉毒杆菌毒素、蓖麻蛋白、霍乱β亚基和葡萄球菌肠毒素B共4种生物毒素进行了测定，检测限达10-15 g，还测定了炭疽杆菌芽孢。伤寒沙门氏菌、鼠疫抗原及食品和环境水样中的沙门氏菌和O-157病毒也可用IECL测定［38,39］。
纵观已有的研究工作，IECL技术正处在蓬勃发展时期，不过也存在一些问题。譬如，把Ru(II)类配合物作为ECL探针标记在抗原(或抗体)上，在有的体系中，无论是探针的ECL性能还是抗原抗体的特异性结合都会受到一些影响。
4 ECL在核酸杂交分析中的应用
利用核酸杂交方法进行病情诊断是一种迅猛发展的技术，近年来这种方法的一个研究热点就是非放射标记。1991年，Blackburn［14］首次报道利用TBR的ECL进行免疫和DNA探针杂交分析，并用于临床诊断。同年，ECL用于PCR产物的快速测定也被报道［40］。这种方法还可对HIV-1的PCR产物进行快速灵敏测定［15,41］。利用PE公司的QPCR 5000系统可进行ECL核酸杂交分析［42］。膀胱纤维变性是一种在白种人中常见的致死性基因紊乱病，病因是位于第10个外显子上的508位苯丙氨酸残基遗失，Stern［43］等利用ECL对该等位基因的特异PCR产物进行测定，并指出这种方法用于其他基因病诊断中的广阔前景。利用这种方法还可对转染T细胞中的TNF-α、IFN-γ和IL-2的mRNA水平进行定D量测定［44］。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)已广泛用于特异性mRNA转录产物的定量和定性分析，把RT-PCR和ECL相结合可进行细胞mRNA表达的灵敏定量分析，进而探讨细胞功能和进化的机理［45］。有人利用DNA寡链TBR的多重标记来提高ECL核酸杂交分析的灵敏度［46］。
5 ECL在氨基酸分析中的应用
用Ru(bpy)2+3的ECL来测定一些丹酰化的氨基酸已有报道［41］。Brune［48］等报道了丝氨酸和亮氨酸的ECL测定，检测限分别为135 p mol和3 p mol。另外，ECL还被用于乙内酰苯硫脲甘氨酸(PTH-glycine)的测定［43］。
6 其它生化分析方面的应用
Janusz［50］等报道了用柠檬酸-甲醇-O2体系对一些抗氧剂和自由基反应的抑制剂进行ECL测定，如β-胡萝卜素、生育酚等。丙酮酸酯是参与动植物体内大量生化反应的重要物质，可利用ECL对其进行测定［51］。有人用ECL测定了辅酶II(NADH)，据此，我们认为可以利用ECL测定一些参与NADH反应的生化物质［52］。一些陆生和海洋生植物中叶绿素也可用ECL测定［53］。Ru(bpy)2+2不具有ECL的性能，然而一些吡啶类生化物质及其经酶水解后的产物能与Ru(bpy)2+2作用生成具有ECL活性的物质，于是通过比较水解前后体系ECL强度的变化可进行酶法分析［54］。
7 结论与展望
ECL技术具有快速、灵敏、重现性好、稳定、动力学范围宽、选择性强等优点，因而，除了可用于药物分析、免疫分析、PCR和DNA分析，还可用于基因序列测定和药物筛选。然而，三联吡啶钌的价格毕竟较为昂贵，因而把三联吡啶钌固定在电极上将有望解决流动分析中试剂的浪费问题。同时，合成和筛选发光性能更好的新标记物对ECL的研究也是很有意义的。ECL技术用于实际样品的分析，干扰问题是难免的，需要进一步解决。ECL技术用于药物和生化分析的潜能才刚刚被人们认识到，相信随着今后研究的深入和广泛，仪器更加的智能化和微型化，这种在生命科学的研究中刚刚崭露头角的前沿技术会不断拓宽其应用的广度。
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