浙江大学生物医学工程与仪器科学学院生物传感器国家专业实验室博士研究生。
关键词: 细胞微环境 光寻址电位传感器 药物筛选 一 引言
实时活体监测细胞是全面了解细胞生理性能及其机制的重要基础。测定细胞内自由离子浓度的较好方法是采用离子敏微电极(ISME)，组合不同的ISME可并行测量细胞内多种离子，如NH4+，Cl－，Na+和Mg2+等。此外，荧光成像也是细胞内微环境监测的一种有用的工具，可测量与细胞信号传递有关的离子浓度、蛋白表达的变化。荧光探针和共聚焦显微技术(细胞三维“切片”扫描)结合，使细胞结构和功能的分析可达到前所未有的精确性和清晰度，能更好地测量细胞内各种离子浓度(游离钙和胞内H+等)。
细胞内生理状态的改变会引起细胞外代谢物的相应变化；因此，测量细胞代谢后胞外微环境的相关参数可以间接监测细胞的生理变化。20世纪90年代，美国分子器件公司(Molecular Device Corporation)开发了一种细胞微生理计，用建立在硅技术基础上的光寻址电位传感器(Light Addressable Potential-metric Sensor，LAPS)检测细胞酸化的微环境。LAPS有一个重要的特征，就是对化学变化的快速反应(ms级)，因此在进行在线监测流动细胞的化学或者生物微环境中pH变化时，LAPS就成为最佳的候选者。微生理计即利用了这一特点：在器件表面贴壁生长活细胞，细胞由于新陈代谢产生酸性物质，LAPS可以快速测量细胞外微环境的pH值变化(可检测到0.0005pH单位)，定量计算细胞质子排出速率，从而可以分析细胞的代谢率。
我们实验室对光LAPS进行了深入的研究，下面简要介绍用于细胞微环境监测的LAPS研究进展以及在药物筛选等方面的应用。
二 基于LAPS的细胞微生理计
美国斯坦福大学和分子器件公司1992年在国际上首次发明了微生理计，主要通过LAPS测量细胞外H+浓度变化，即酸化率指标，间接监测细胞的生理变化，目前微生理计已经获得广泛的应用。
细胞微生理计可以作为pH值的监测器，监测正常细胞或病变细胞在各种药物作用下的微环境变化。我们实验室利用细胞微生理计研究了氟尿嘧啶、胰岛素、氯丙嗪等药物对乳鼠肾细胞代谢的影响。结果表明，图1中，微生理计可以明显地反映出乳鼠肾细胞在这三种不同药物作用下细胞胞外酸化率的变化：在氯丙嗪作用下，细胞外酸化率上升，并且浓度越大，酸化率变化越大；在氟尿嘧啶作用下，细胞外相对酸化率下降，并且浓度越大，相对于培养液的酸化率下降越大；在胰岛素作用下，细胞外相对酸化率下降，并且浓度越大，相对于培养液的酸化率下降越大。通过微生理计观察药物作用下细胞胞外的酸化率，可以反映出各种药物对于细胞新陈代谢的影响。
细胞微生理计可以动态监视细胞新陈代谢的过程，和受体的激活，可能可以用来进行中药的筛选。我们对枸杞、黄芪、川芎等药物进行了实验来确定可行性。结果表明，图2中，两种药物作用于乳鼠肾细胞后，胞外pH不断变化。当灌流药物(如图中的方块)的时候，光生电流下降，即细胞外pH下降，细胞向外环境排出质子；而当灌流培养液(如图中的圆圈)时，光生电流升高，细胞的代谢水平又恢复到正常水平。图3显示的是川芎的药效图，方块表示为药物的作用，圆圈表示为培养液的作用。图4是不同浓度川芎作用下的细胞相对酸化率，可以表明该微生理计可以用来估计药物的有效浓度。
三 基于LAPS的并行监测多种参数的细胞微生理计
化学传感器种类很多，原理各异，使用的条件也不尽相同，但是功能较为单一，能值测量某种具体的参数，因此，实现多参数的并行监测是化学传感器的发展方向之一。微生理计能够通过测量胞外H+离子浓度变化来间接监测细胞的生理变化，然而在研究受体的激活、配体和受体的相互作用时，仅用酸化率这个指标作为衡量标准是不全面的，还需要同时测量细胞外多种离子的浓度变化。
LAPS传感器采用光寻址的模式，可以通过多个测量位点沉积不同离子敏感膜来进行多参数的测量。我们实验室从1994年开始，一直致力于多功能细胞微生理计的研究，自主设计并实现了基于MLAPS(多光源电位寻址传感器)的多功能细胞微生理计，如图5所示，且申报了发明专利。
该多功能细胞微生理计通过在LAPS表面采用硅微机械加工和PVC成膜技术，沉积不同的离子敏感膜，用多个不同频率的调制光分别照射LAPS相应的多个敏感膜(如K+，Ca2+，H+和Cl－等)，测量得到的光生电流包含了多种敏感膜的响应，由计算机采用数字补偿和动态频谱分析等信号处理方法，把多种离子响应分离出来，同时计算出多种离子浓度的变化率。
使用这个多功能微生理计系统，我们研究了苯妥英钠、苯巴比妥钠和青霉素钠对乳鼠心肌细胞离子通道的影响。结果表明，该系统可以用来监测正常细胞和病变细胞在各种药物作用的细胞胞外微环境的变化，包括酸化率和多种离子，综合评价药物作用对于细胞代谢的正负效应(刺激或抑制)，从而进行药物评价和药理探索。
我们实验室最近还改良了以上系统中的多光源系统，报道了一种利用微透镜阵列组成的多光源系统用于高速化学图像传感器，见图6。该多光源系统能够同时产生一列不同频率的调制光，利用该系统将不同频率的光调整位置，对LAPS器件上制备了不同离子敏感膜的部分进行照射。通过对频率调制盘的孔数进行控制，不同频率光引起的光生电流之间不会有谐波的干扰，提高了灵敏度，减小了系统的体积。
四 总结与展望
LAPS由于具有灵敏度高，响应快，制作工艺简单等特点，并解决了传统器件培养细胞位点固定的问题，因此受到很大的关注。基于LAPS的细胞微生理计在很多领域得到了广泛的应用，对于药物作用的实验也表明它可以用来确定药物对于细胞代谢的影响作用以及药物的筛选。未来的发展方向是将多功能微生理计结合其它的传感器，结合新型的材料和芯片加工技术，同时研究细胞内外的多个生理参数，为药物机理探索或评价提供更有力和充分的依据。我们实验室已经设计出一种结合了阻抗分析、动作电位测量以及多功能微生理计的多功能细胞参数检测仪，并正在进行更深入的实验。 （全文完） 来源：《世界医疗器械》 出版日期：2007年8月 | 
