[转帖]临床检验仪器设备与分析技术的发展现状与未来 (上)

临床检验仪器设备与分析技术的发展现状与未来 (上)
王成斌 丛玉隆

王成斌先生，博士，副教授、副主任医师，解放军总医院临床检验科副主任，中华医学会检验分会临床免疫专家委员会委员、全军检验医学委员会免疫学专题委员会委员；丛玉隆先生，教授、主任医师、博士生导师，解放军总医院临床检验科主任，中华医学会检验学分会主任委员。

　　20世纪60年代以后，随着新技术革命浪潮的兴起，电子学、材料学等学科划时代的发展和电子计算机的应用，为临床检验仪器的研制提供了基础。近20年来，医学、生理学、生物化学等学科研究的深入使生物体信息量的不断增加，极大地促进了临床医生对生物样品中检测项目的需求，而生物样品中诸如激素等对临床疾病诊断具有重要作用的物质非常微量，为发展快速灵敏的检验仪器产生了巨大的推动力。

　　荧光偏振、化学发光、分子标记、生物传感、生物芯片等高新技术的出现和应用，不仅使临床检验的仪器设备不断向灵敏度更高、需要样品量更少、分析速度更快、操作更方便的方向发展，而且使检验仪器的更新周期大为缩短。临床检验仪器的“模块化”和“全实验室自动化”的实现，打破了传统临床检验的技术分工模式，使得一份样品可以自动完成所有血液、生化、免疫等不同检测项目的要求。而临床检验仪器的小型化、简便化使得检验人员、临床医护人员、甚至病人自己或其亲属可以在病人床边或家中完成某些通常需要在专门实验室才能完成的检验项目的检测。下面就对目前临床实验室常用检验技术及仪器设备的发展现状及未来趋势作一简要概述。

一 临床检验技术及仪器设备的发展现状

1. 血细胞分析技术及仪器设备

　　a. 血细胞分析仪

　　血细胞分析包括对人体血液中不同类型细胞(白细胞、红细胞、血小板)的数量及相关参数(白细胞分类、红细胞内血红蛋白含量等)的分析。传统的血液细胞分析技术主要用显微镜计数不同类型的细胞数量，涂片染色处理后用显微镜下进行白细胞分类。1948年，一位名叫库尔特(Wallance H. Coulter)的美国电器工程师在实验中发现，微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化，这一发现后来被称之为电阻抗原理，又称为库尔特原理(Coulter Principle)。上世纪50年代，通过电阻抗技术原理设计的血细胞计数仪问世，使临床检验中的血细胞分析发生了革命性的变化，这一技术目前在全自动血细胞分析仪设计中仍然广泛使用。70年代，由于浮动界标等技术的应用，使全血血小板计数得以实现。90年代，三分群(根据细胞体积将白细胞分为大、中、小三群)血液分析仪开始广泛应用，而后血细胞自动涂片和分类仪器问世；近年来，全自动五分类血液分析仪已成为各大型医院检验科常规检验的主要仪器，它不仅可以准确计数血液中白细胞、红细胞、血小板，分类白细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，还可以提示异常细胞和幼稚细胞的存在，同时可分析血红蛋白(HBG)、血红蛋白浓度分布宽度、平均红细胞体积(MCV)、红细胞体积分布宽度(RDW)、网织红细胞、平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、血小板比率等30多项参数，每小时可分析超过150个样品，多数检测项目的批内变异系数(Coefficient of Variation，CV)小于5。

　　b. 血细胞分析技术

　　(1) 血白细胞计数

　　血细胞分析仪中的细胞计数主要根据血细胞的不良导电性实现。在由电解质溶液构成的稳定电路中通过一个血细胞时，由于血细胞的导电性低于电解质导致电路中的电阻增加，结果引起瞬间的电压变化而出现一个脉冲信号，所产生脉冲信号经过放大、甄别、整形后，送入计数系统计数。白细胞计数前先用溶血剂去除红细胞的干扰，而在计数红细胞时由于白细胞相对量很少，其干扰可以被忽略不计。由于细胞产生的脉冲强度与细胞体积成正比，血液中的血小板体积与其它细胞相差较大，很容易通过设定其体积的阈值范围与其它细胞进行甄别。为了使血细胞计数及相关参数检测更加准确，目前很多血细胞分析仪器均引入光散射分析技术以及某些特殊技术，如三次计数决定设置以避免偶然的计数错误，扫流(Sweep Flow)、鞘流(Sheeth Flow)技术及防返流装置防止计数后红细胞返流对血小板计数的影响，浮动界标技术和拟合曲线避免小红细胞和大血小板存在导致血小板计数错误，延时计数技术防止样品中血小板数过低对结果的影响。

　　(2) 白细胞分类技术

　　不同类型的白细胞功能不同，白细胞分类在临床疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要作用。最初的血细胞分析仪对白细胞的分类是根据电阻抗原理，即不同细胞大小在电路中所产生的脉冲强度不同，从而将血液中的白细胞分成三群：以淋巴细胞为主的小细胞群、以粒细胞为主的大细胞群和单核细胞为主的中间细胞群，此种分类显然不能满足临床的需要。后来仪器设计人员通过联合不同的技术方法，最终实现了传统白细胞的五分类：嗜中性、嗜酸性、嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞。这些方法包括：(a)在电阻抗技术的基础上联合电导和光散射技术，通过对不同类型白细胞的体积、胞浆结构和颗粒性质差异进行区分；(b)电阻抗结合射频技术，利用射频电流可透过细胞膜，分析细胞体积、细胞核及细胞颗粒的差异；(c)光散射结合化学染色技术，利用不同类型白细胞内过氧化物酶活性及对化学试剂损伤耐受性的差异，结合光散射技术对细胞体积的分析；(d)多角度偏振光散射技术，根据细胞通过激光束照射后不同角度的散射光，分析不同白细胞的大小、胞浆结构、胞核特征、颗粒分布等。

　　尽管当今自动血细胞分析仪在设计过程中引用了大量的高新技术以确保白细胞分类的准确性，但由于不同生理、病理因素的影响，可导致血细胞形态、结构出现超出常规的异常变化，结果就是我们在日常血细胞分析过程中仪器因无法识别细胞形态而报警现象，而解决这一问题的唯一方法就是利用传统血涂片染色后显微镜下的人工识别。所谓流水线化即是将血常规分析中的所有步骤和项目进行系统性联合，将血常规分析、网织红细胞分析、血片的制备(选择、涂片、编号、染色、干燥)等系列步骤通过仪器自动完成。

2. 尿液分析技术及仪器设备

　　a. 尿液分析仪器

　　尿液分析是指对尿液中化学物质和固型成分的形态学分析。传统的化学物质分析主要是通过其与化学试剂的显色、沉淀反应，而固型主要通过显微镜观察。20世纪50年代尿液分析试剂带的出现给尿液分析带来方便；70年代半自动尿液分析仪开始应用，80年代末尿沉渣自动分析仪研制成功，实现了尿液分析的准确定量，提高了尿液分析的敏感性和特异性；90年代全自动尿液分析仪和尿沉渣分析仪相继问市，不仅减轻了临床实验室人员的劳动强度，而且大大提高了尿液分析的速度。目前的全自动尿液分析仪可一次完成超过12项分析指标，每小时可分析多个样品。对尿液中固型成分的分析不需要离心到沉渣，从而可避免离心过程中有形成分的破坏和变形，而且分析结果可给出红细胞、白细胞的相关参数和直方图，更方便临床医生理解。

　　b. 尿液分析技术

　　(1) 尿液化学成分分析

　　目前此项分析多应用干化学方法，它采用的是多层膜结构技术，从上往下分为四层：滤过层、试剂层、吸水层和支持层。尿液样品加到试剂带上后，首先经过一层尼龙膜结构滤过，防止尿液中有形成分及大分子物质进入试剂层，液体尿样进入试剂层与相应试剂发生呈色反应，吸水层保证尿样快速均匀地浸入和防止尿样流入相邻反应区(一条试剂带相隔集合多项实验指标)，最下一层为防渗支持物。试剂带上其呈色强弱与尿样中的化学成分浓度相关，仪器可通过呈色后的光反射强度计算其浓度。

　　(2) 尿沉渣分析

　　目前具有先进代表性的尿沉渣分析仪是利用流式细胞结合电阻抗技术，由于尿液中有形成分与荧光剂的结合能力不同、形态各异、大小不一，电阻抗技术和流式细胞激光束照射后的前向小角度光散射分析可以区分细胞的体积和形态，而流式细胞激光束照射后垂直光散射的荧光强度可以分析细胞及其它颗粒物质表面蛋白质等成分和内部结构，从而达到对尿液中有形成分的定量分析。

3. 临床免疫分析技术及其自动化仪器

　　a. 临床免疫分析仪器

　　从上世纪70~80年代，激光浊度分析仪开始应用于临床实验室抗原、抗体的检测，免疫自动化分析仪器发展迅猛，特别是近十多年，全自动化的免疫浊度分析仪、荧光免疫分析仪、化学发光免疫分析仪、电化学发光免疫分析仪、酶免疫分析仪、荧光磁微粒酶免疫分析仪、生物芯片阵列免疫分析仪为临床实验室的免疫分析提供了简便(完全自动化，自动进样及样品处理、自动分析、自动输出结果)、高效(一份样品可同时检测数十个项目)、快速(每小时可分析近200个测试)、高灵敏度(可达10-17mol/L以上)和高精密度(CV<5%)的检测工具。

　　b. 临床免疫分析技术

　　(1) 免疫浊度分析

　　抗原、抗体反应后在溶液中形成细小微粒子，当一定波长的光束通过时可产生吸收和散射，其光吸收或散射强度与抗原、抗体的结合量成正比。

　　(2) 荧光免疫分析

　　荧光免疫分析技术是应用荧光技术的高灵敏度与免疫技术高特异性的结合。荧光素被标记到抗原或抗体上，当它们与待测抗体或抗原发生反应后，所结合抗原抗体上的荧光强度与待测样品中的抗体或抗原浓度相关。

　　(3) 酶免疫分析

　　酶免疫分析技术是通过酶的催化活性和放大作用与抗原、抗体特异反应性相结合的一种微量分析方法。酶标记抗原(抗体)与待测抗体(抗原)结合后，洗去未结合的酶标记成分，再加入酶底物，标记在抗原(抗体)上的酶可催化底物发生呈色反应，其产物的呈色强度与酶标记抗原、抗体浓度相关。

　　(4) 化学发光免疫分析

　　发光剂由于吸收抗原、抗体反应过程中释放的化学能而进入激发状态，激发态发光剂返回基态过程中又释放光能而产生发光，其发光强度取决于反应速度，而反应速度又依赖于抗原、抗体浓度。

　　(5) 电化学发光免疫分析

　　电化学发光与一般化学发光的区别在于：用电阻替代化学能激发发光物质。发光剂循环利用，发光强度高且持续稳定。应用微粒子作为包被载体，不需分离未结合标记物及发光剂。

　　(6) 生物芯片阵列免疫分析

　　用生物芯片作为平台进行免疫测定。固定在芯片上抗体、待测抗原、酶标抗体形成夹心反应，酶催化化学发光底物产生发光，用CCD照相机拍摄发光强度，分析样品中待测物浓度。

　　(7) 综合免疫分析技术

　　目前很多全自动化免疫分析仪器都采用了上述不同免疫分析技术的联合应用。如：利用荧光与酶免疫分析技术、化学发光与酶免疫技术、生物芯片、酶、化学发光免疫分析技术以及加入胶乳微粒载体、磁微粒载体、增敏发光剂等技术手段，从而扩大了全自动定量免疫分析仪器的检测范围，提高了项目检测的灵敏度、特异性和稳定性，缩短了分析时间。

4. 微生物学分析技术及其自动化仪器

　　a. 微生物分析仪器

　　(1) 细胞培养

　　微生物学分析的主要内容是细菌培养、鉴定和药物敏感试验。传统的微生物学分析主要通过手工操作和肉眼观察，即将待检样品接种到培养瓶后置于培养箱(室)中培养，每日观察有无细菌生长(混浊)。上世纪70年代出现了第一代自动化细菌培养仪器，80年代第二代产品问世，90年代后以不同检测原理生产的第三代全自动化细菌培养仪产品开始在临床实验室广泛应用。三代产品之间的技术差异在于：第二代产品用红外光谱技术替代放射性测定，同时检测样品量、检测速度、可检测细菌种类，检测结果的特异性、自动化程度均有所提高。第三代产品可在培养过程中进行检测，无需转移培养瓶。应用瓶外检测技术，无需将探针插入培养瓶，减低污染机会。可每隔10~30min检测一次，缩短了阳性菌的检出时间。检测敏感性增加(<102/mL)。实现了真正意义上的全自动化，整个培养过程无需人工介入，最短2h可显示细菌生长。

　　(2) 细菌鉴定及药物敏感试验

　　传统的细菌鉴定方法是根据不同细菌的代谢特征，通过手工方法对细胞进行一系列生化反应实现的。上世纪70年代，细菌鉴定仪器开始在临床实验室应用。90年代初，全自动细菌鉴定系统开始进入市场。近十余年来细菌鉴定的数码分类技术得到了快速发展，这一技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验，鉴定细菌最快2~3h，药敏试验3~5h，可鉴定数百种细菌，药敏试验所选择抗生素也在上百种。

　　b. 微生物分析技术

　　(1) 细菌培养

　　(a) 红外光谱分析技术

　　通过CO2对红外线的吸收原理，用红外光谱仪检测细菌培养过程中代射产物CO2，以此判断细菌的存在。

　　(b) 电传导分析技术

　　利用细胞代射过程中由于消耗培养基并产生代射产物，从而引起培养基电传导阻抗增加的原理，判断细菌的存在。

　　(c) pH分析技术

　　细菌代谢过程中产生的CO2在水溶液中产生氢离子增加，从而引起pH下降，以此判断细菌的存在。

　　(d) 荧光传感器技术

　　细菌代谢过程中产生的CO2可激活结合在培养瓶底部的荧光传感器产生荧光，其荧光强度依赖于细菌密度。

　　(e) 均质荧光技术

　　细菌代谢过程中产生的CO2、pH改变或氧化还原电位变化，可使培养基中的荧光分子猝灭。

　　(2) 细菌鉴定及药物敏感试验

　　(a) 代谢产物分析鉴定细菌技术

　　通过细菌代谢过程中对培养基的碳源、氮源利用能力不同所导致生长环境pH的变化；用荧光标记细菌表面特异酶的底物，不同的细菌作用于不同的底物，激发出不同强度的荧光；不同细菌利用培养基成分后产生浊度的差异；即可鉴定不同的细菌。

　　(b) 数码编码细菌鉴定技术

　　应用数码编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，通过查阅已建立的数码库鉴定细菌名称。

　　(c) 抗生素微量稀释药敏试验

　　在抗生素微量稀释条孔或条板中加入菌悬液培养，根据其与对照孔(板)中细菌生长的浊度分析，培养基中颜色、荧光强度的变化，判断细胞对某种抗生素敏感或耐药。

5. 临床生化分析技术及仪器设备

　　a. 临床生化分析仪器

　　临床生化检验技术、检验项目和检验仪器在临床检验学科的发展中都具有领先地位，临床生化检测仪器最早产生于上世纪50年代，60年代半自动生化分析仪出现，70年代自动生化分析开始在临床实验室应用。随着电子计算机及其它相关学科的发展，80年代以后至今的20多年中，自动生化分析仪走上了快速发展之路，自动化程度更高(项目录入条码化、分析自动化，结果格式化，开机、关机、清洗、保养、故障检测智能化)、分析项目范围更广(任意增加新项目，随意编制项目的分析参数)、配置更方便(由于目前仪器可以按模块化配置，打破了仪器配置按台计算的概念，不同实验室、同一实验室不同发展时期可以按照其规模配置模块数量，使不同级别实验室之间的分析水平差距缩小)，分析速度更快(可以无限扩大模块数量)，维修更方便(某一模块发生故障维修，不影响其它模块的正常运行。

　　b. 临床生化分析技术

　　(1) 液面感应技术

　　在全自动生化分析仪的取样和吸取试剂的针头旁伴有液面感应探针。可以防止针头插入样品或试剂较深部位造成污染；在样品、试剂少的情况下防止针头接触样品杯、血凝块和试剂瓶底生成吸样不准或损毁针头。在样品、试剂较少情况下针头仍可吸取；有些仪器由于有感应器装置，当针头触碰到固体时会自动停止或报警。

　　(2) 随量跟踪技术

　　取样和吸取试剂的针头插入液面的深度可根据取量的多少自动调整。

　　(3) 取样防堵技术

　　吸取试剂或取样针由于完全或不完全堵塞造成吸取液体不准是造成检测结果错误的重要原因，目前一些自动生化分析仪的探针能自动检测取样针血液或试剂中纤维蛋白质或其它杂物堵针，堵针后根据内置压力感受器进行处理。

　　(4) 条形码自动识读技术

　　条形码扫描系统自动识别样品架及样品编号，自动识别试剂、校准品及其批号、失效期，有的还可识别校验校准曲线等信息。

　　(5) 后分光分析技术

　　传统自动生化分析仪采用前分光测定技术，即先将白色光用滤光片、棱镜或光栅转换到单色光，再照射到样品杯，测定样品的吸光度。而现代大多生化分析仪采用后分光测量技术，即将白光先照到样品杯上，然后再用光栅分光，同时用一列发光二极管排在光栅后面作为检测器，这样可同时选用双波长或多波长进行检测，这样可降低比色的噪声，提高分析的精确度和减少故障率。

　　(6) 双波长测定技术

　　在样品检测过程中设主、副波长，主波长检测样品与试剂反应的呈色变化，副波长检测样品和试剂本身的颜色，从而可以减少样品中脂血、溶血、黄疸等因素的影响。

　　(7) 双试剂测定技术

　　先加第一试剂与样品作用一段时间，以消除其中容易导致干扰反应的物质，再加入第二试剂进行检测反应。

　　(8) 连续监测反应速率技术

　　在线性范围内，连续监测样品与试剂反应导致的呈色变化，通过单位时间内呈色反应的变化率，计算样品中的待测物浓度，这样可以大大减少样品中很多因素的干扰。

（未完待续）

来源：《世界医疗器械》

出版日期：2007年6月

 

 

 

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