丛玉隆 先生, 教授、主任医师、博士生导师，解放军总医院临床检验科主任，中华医学会检验学分会主任委员。
关键词: 流式细胞术 流式细胞仪
流式细胞仪(Flow Cytometer)是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)是上世纪70年代发展起来的一项新技术，它通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。这种分析仪器综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、对所需的细胞或颗粒可以进行分选等特点，在细胞生物学、分子生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、遗传学等方面得到了广泛的应用。近年来，随着操作简单的各新型流式细胞仪的相继问世，以及新的荧光染料的不断发现，使实验费用日益降低，流式细胞仪从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验室技术提高到一个新水平。
目前在医学实验室使用的流式细胞仪有两类，按其使用的范围和功能，可将其分别称为通用型和专用型，前者可分析各种细胞或粒子悬液中固体成分的性质，后者是专用于某类标本的细胞分析。如目前多数医学实验室使用的各类型五分类血细胞分析仪、尿有形成分分析仪等。本文仅就检验科常规工作中流式细胞仪的应用范围和本人体会简述如下，上半部分先介绍通用型FCM的应用。
一 DNA含量分析
用FCM进行单个细胞DNA定量，临床上主要用于细胞遗传学和细胞动力学的研究。从分子生物学角度，将增殖期细胞分为四个阶段，第一阶段为DNA复制前期(G1期)，此阶段DNA含量为2N，第二阶段为DNA复制期(S期)，此期DNA含量在2N~4N之间，一旦DNA含量为4N，即进入DNA复制后期(G2期)。因此，FCM DNA定量可将形态上不易区别的群体细胞分成三个亚群体(即G1期、S期、G2期)，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关，并可预示某些疾病的预后。有作者对组织学证实的慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和晚期胃癌组织作流式细胞DNA分析，结果显示三者DNA非倍体率分别为0(0/10例)、20%(2/10)和90%(36/40)；同时三者在S期细胞比率和细胞增殖指数也顺序增加，三者之间差异有显著性。
应用流式细胞术，对57例胃肠道平滑肌肿瘤石蜡样组织块的瘤细胞DNA含量及细胞周期分析进行检测分析，结果表明，25例平滑肌肉瘤的DNA指数(DNA grading Index，DI)为1.81±0.07，明显高于32例平滑肌瘤1.39±0.15(P<0.001)，并且有很高的异倍体率(100%)(P<0.005)。平滑肌瘤和平滑肌肉瘤的S期细胞比率分别为(10.08±3.22)%和(18.03±3.28)%，具有显著统计学差异(P<0.001)。DI< 1.10者22例，全部生存100%，平均生存时间95个月。胃肠道平滑肌肿瘤的细胞DNA含量及S期细胞比率，可作为判断该肿瘤良恶性及预后的一个可靠的客观指标。
有文献报告应用流式细胞术对鼻咽、口腔、胃、宫颈以及宫内膜组织的208例癌前病变细胞DNA倍体进行了分析，并探讨了其与病理学变化的关系及DNA非整倍体与癌变的关系。分析结果表明，163例为DNA二倍体，45例为DNA非整倍体，DI随病变增生程度的加重而增高，DNA非整倍体的出现率也随病变增生度的加重而增高。在45例DNA非整倍体中，22例发生癌变。DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病变发生早期癌变的一个早期标志。
近些年来，由于临床药理学和细胞动力学的研究，使肿瘤化疗有了较大进展。通过DNA含量分析的细胞周期分布，可反映肿瘤细胞的增殖状态，有的放矢地使用细胞周期特异性和非周期特异性药物，最大程度地杀死肿瘤细胞保留正常细胞。应用FCM，Gray分析了115例急性白血病患者细胞动力学变化及其与化疗反应的关系，表明S期细胞越多，化疗后肿瘤细胞减少越明显，但与完全缓解率无明显关系；Ardel等使用FCM对12例病人外周血白细胞进行了DNA定量分析，结果发现大多数对化疗药物有效的病例，在血液学和临床显效前，S期细胞增多，他认为这对于早期预报临床疗效有一定价值。Hillen曾观察完全缓解患者细胞动力学变化，发现在缓解时，增殖期细胞群低者易于复发，因而提出FCM测量可预示复发的可能性。
综上所述，DNA含量分析在临床诊治中大致有如下定义：
1. FCM的测定在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
(1)DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。
a. DNA指数和非整倍体出现率随上皮增生程度增高而增高，非整倍体的癌前病变，经随访发现近半数发生癌变；
b. FCM可常规作为某些患者随访手段和筛选癌变细胞的工具。
(2)淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能做出早期诊断之前，FCM可以提供确切的诊断信息。流式细胞术对于淋巴瘤的早期诊断有比形态学更为敏感、准确的优点。
(3)DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待，如卵巢交界瘤的良恶性判断。
(4)形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能，如甲状腺肿瘤和葡萄胎恶变。
(5)DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标。
2. 流式参数的预后意义
用流式细胞仪技术对肿瘤细胞进行DNA含量和DNA倍体及S期分析并与肿瘤患者的预后相联系。
3. FCM在肿瘤脱落细胞学检查中的应用
Klein等提出的FCM诊断肿瘤细胞的标准如下：
a.发现DNA非整倍体细胞峰诊断为恶性肿瘤细胞。
b.如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四倍体细胞峰和大于15%的超二倍体细胞峰(S期细胞)，并伴有G0/1的CV值增大，并伴有大于10%~ 15%的超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰位，诊断为可疑癌，应定期随访。
4. FCM的DNA分析有利于化疗药物的选择和化疗方案的制定
二 流式细胞术在血液学的应用
1. 白血病的免疫分型
白血病的分型对选择化疗方案和判断预后有重要的参考价值，近几年来，在MICM分型基础上，建立了WHO白血病分类法。所谓MICM分型就是根据白血病细胞形态学特征(Morphology，M)、免疫学标记(Immunology，I)、细胞遗传学变化(Cytogenetics，C)和分子遗传学(Moleculor Genetis，M)特点，综合分析进行白血病分型。
白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MICM分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。
目前公认的系列特异性指标是：
(1)T淋巴细胞系：mCD3或cCD3、TCR；
(2)B淋巴细胞系：cCD22或cCD79；
(3)髓系：cyMPO或cyCD13。
一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。
(1)ALL免疫分型(四型分类法)见表1。
(2)AML免疫表型见表2。
(3)免疫分型的价值有：能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型；能正确鉴别AML中的M0、M6、M7；诊断双系或双表型白血病；发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病；诊断少见疑难白血病(如毛细胞性白血病)。
2. 流式细胞仪用于阵发性睡眠性血红蛋白尿诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血，临床表现以与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿为特征，可伴有全血细胞减少或反复血栓形成。
本病的基本缺陷是影响了膜蛋白结构，使红细胞对正常血清上补体特别敏感而发生溶血。患者体内红细胞呈不均一性，一类对补体敏感而另一类(正常红细胞)则不敏感。临床表现和血红蛋白尿的发作频度，决定于补体敏感细胞的数量。这类红细胞每一单位抗体比正常红细胞固定更多补体C1，而每一C1分子又能比正常红细胞促使更多C3b固定于红细胞膜上。实验发现PNH红细胞膜蛋白衰变因子缺乏，该因子有降解C3转化酶作用；当缺乏时，C3转化酶趋于稳定状态，所以激活了大量C3，并转化为C3b。C3b大量在膜上呈丛状聚集，使更多C5转化，结合到膜上，最后形成膜攻击单位，导致溶血；同时，对补体溶血高度敏感的红细胞，其胞膜表面的乙酰胆碱酯酶活性降低，降低的程度与溶血的严重度有关。
应用单克隆抗体证实乙酰胆碱酯酶活性降低是由于膜上引起酶活性的蛋白质缺乏。传统的诊断方法，除了临床表现外，主要依赖血象、骨髓象、血液生化检查、尿液检查和特异性血清实验(包括Ham实验、蔗糖溶血实验、热溶血实验、蛇毒因子溶血实验等)，而这一系列的实验室检查只是证实了由于CD59(反应性溶血膜抑制物[MIRL]、膜攻击复合物抑制因子[MACIF])和CD55(衰变加速因子[DAF])的缺陷导致了红细胞对补体的异常敏感而引起溶血现象的发生。应用流式细胞术和抗CD55、CD59和CD16单克隆抗体，对PNH患者的红细胞、粒细胞、血小板进行分析，可证实有上述蛋白表达缺陷的血细胞的存在及在全部血细胞中所占的百分比。
正常人红细胞、网织红细胞、粒细胞、血小板CD59表达完全阳性，而PNH患者则分为三型：
Ⅰ型：CD59表达完全阳性，其荧光强度与正常人阳性峰所在荧光道数相近；
Ⅱ型：CD59表达部分阳性，其荧光强度处于Ⅰ型及Ⅲ型之间；
Ⅲ型：CD59表达完全阳性。
研究证明，Ⅲ型细胞对补体最敏感，最容易发生补体介导的血管内溶血，其次是Ⅱ型细胞，Ⅰ型细胞对补体最不敏感。分析一个细胞系中各型细胞所占的百分比，就可以评价其疾病的严重程度。
特异地分析网织红细胞的CD59的表达，对于PNH的诊断及病情估价有非常重要的意义。
3.在抗血小板抗体、抗中性粒细胞抗体、抗淋巴细胞抗体分析方面的应用
使用FCM测量血清和细胞上相关抗体方法不断用于抗血小板、抗白细胞、抗淋巴细胞抗体的分析。测量方法原理相似于间接、直接Coombs试验。间接法是病人血清与对照正常人血小板一起孵育后，与标记荧光的抗人球蛋白混匀，结合后，放入FCM进行荧光分析；直接法是病人血小板与荧光标记的抗人球蛋白反应后进行测量，其敏感度高于间接法。有文献报道，FCM测量血小板抗体IgG的量与血小板减少程度呈负相关。即血中抗血小板抗体IgG的量与血小板减少呈负相关，当同时存在IgG与IgM时，减少更为明显。
中性粒细胞减少症患者可能由于特异性粒细胞自身抗体、特异性粒细胞同种异体抗体或输血后抗HLA抗体的产生，而致使抗中性粒细胞抗体的形成。结合或游离抗体的检测方法与上述血小板抗体检测法相同。
屡有文献报道FCM在组织交叉试验方面的应用。其方法是供体淋巴细胞与受体血清一起孵育，然后再与荧光试剂标记的抗人免疫球蛋白孵育，测量结果与正常对照比较。如果平均通道荧光强度偏移则视为阳性。实验证实，FCM测量获得的阳性结果，在肾移植中，可预示早期移植功能。研究表明，FCM交叉配合试验检测较淋巴细胞毒试验要敏感的多。
4. 粒细胞功能的分析
通过FCM可评价各种中性粒细胞的功能，包括膜潜能改变、吞噬功能分析和调理作用的研究。这些分析在研究烧伤水肿，移植和其它状态中所见的继发性中性粒细胞功能缺陷是非常有用的。Bass等阐述了检查中性粒细胞氧化能力的流式细胞法。这种方法使用复合二乙酸和2，-7，二氯荧光素，它以非荧光复合物形式进入细胞内，过氧化氢的存在引起荧光部分的形成。FCM就是测量这种变化，而检测粒细胞功能。铃木使用荧光素标化的人IgG粒子与白细胞一起孵育，分别使用FCM测量孵育后白细胞荧光强度的组方图，诊断粒细胞的吞噬功能，笔者认为FCM可作为检测粒细胞功能的良好仪器。
5. 用于微量细胞群检查
由于血型不符造成的新生儿溶血症是临床的多发病，因此，如何能早期诊断在孕育阳性胎儿的Rh阴性母体中有无胎—母出血，对于诊断和治疗都有非常重要的意义。Cupp设计的免疫荧光的方法可以通过FCM从Rh(+)/Rh(-)红细胞为1∶100000比例的血液中，检测出Rh(+)红细胞，这种敏感度足以用作检查胎—母出血的筛选实验。
常规的疟原虫检查法是将病人血液制成血涂片，经瑞氏染色后，在光学显微镜下检查。由于涂片中疟原虫分布不均匀，计数细胞少及人为误差，检出率较低。Whaum等应用FCM法大大提高了诊断阳性率。因为成熟红细胞无核，无DNA成分，当感染了疟原虫时，等于镶入了DNA成分，此时用丫啶橙染色定能发射绿色荧光，可从大量的红细胞中找到极少量的疟原虫感染细胞。
三 细胞抗原的分析
T细胞亚群主要包括CD3、CD4、CD8。B细胞包括CD19、CD20、CD22，其比例变化与体液免疫功能有关，正常个体约为2∶1，但在某些疾病时，可出现比例倒置。Cosimi使用FCM监视同种肾移植病人淋巴细胞亚群。在Th/Ts高比例病人，除非与献肾者HLA相一致，或T细胞总数是低的，否则预示“排异”的危险性增加，而在Th/Ts比例倒置的病人“排异”则很少发生。应用FCM测量Th/Ts变化，还可作为诊断艾滋病的重要筛选指标。CD4/CD8的变化对SARS的诊断、疗效和预后估计也有一定的价值。
最近研究显示，FCM也可用于特异性细胞质内或细胞核上抗原的检测，后者能分析细胞的增殖状态，并能协同其它实验指标预示疾病的预后。Ki-67是抗核抗原的单克隆抗体可与人类处于晚G1、S、G2、M期所有细胞核抗原反应，检测处于增殖周期的细胞。G0期细胞不被Ki-67标记。Clevenger等阐述了可识别被称为P105的核抗原的单克隆抗体。P105在整个细胞增殖周期中表达增加，可用来研究肿瘤的增殖状态。与Ki-67相反，P105可经受常规的固定，石蜡包埋，核提取。P105的表达与S、G2、M期细胞数呈正相关。
最近HLA-B27用于流式细胞仪检测不断在临床使用，HLA-B27是MHCⅠ类抗原，在有核细胞上广泛表达，HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关。文献报道，使用流式细胞仪可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27，实验的敏感度为100%，特异性为97.5%。
四 流式细胞术在器官移植中的应用
实体组织和骨髓的移植作为一种行之有效的治疗方案，已经广泛地应用于临床医学之中，并为很多看来已经“无药可医”的疾病拓展了一个很广阔的治疗空间。然而，器官来源的缺乏和诸如移植物排斥、移植物抗宿主病和原发病的复发等等复杂因素还严重地威胁着患者和移植物的存活期。为解决这一难题，临床学家一直致力于解决以下两方面的问题：(1)最佳的供者与受者的组织配型；(2)改善移植后患者的维持治疗，其中包括新的免疫抑制剂的应用和对移植物排斥状态的实时监控。
而流式细胞术恰恰是在移植前后为同种异体移植的受者提供了一个较传统方法更为灵敏的监控方法，主要包括两个方面：(1)检测受者血清中抗供者的anti-HLA抗体；(2)监测移植期间受者的免疫状态。
1. 移植前
在肾移植中，流式细胞术是一个非常有效的判断供者与受者之间配型是否恰当的工具。因很难寻找到合适的配型，恰当的供体，且配型的正确与否直接关系到移植的成败。所以，用流式细胞术检测受者血清中抗供者的anti-HLA抗体也就成为移植前非常关键的实验。
流式细胞术应用之前，试验是检测抗供者抗体通过补体依赖性细胞毒交叉配型实验(Complement-Dependent CytotoXicity CrossMatch，CDCXM)。即：供体淋巴细胞与选择的受体血清混合起来。同补体一同孵育，通过染色区别死亡细胞，而细胞死亡的程度可决定CDCXM是否阳性。尽管CDCXM阳性对于一些急进型排斥反应有一定价值，但CDCXM阴性却不能确认抗体存在和保证移植物的长期存活。有文献报道，几例CDCXM阴性的患者肾移植后发生了加速型排斥反应。
而流式细胞术配型实验(Flow Cytometric crossmatch，FCXM)与CDCXM相比，却有了相当大的优越性。在FCXM，供者细胞同受者血清混合，代替补体的是标记了荧光素的抗人免疫球蛋白。如果抗供者抗体存在，它们就将同淋巴细胞结合，使得标记的荧光强度加强。用流式细胞亦多参数分析就可以区别出哪一种淋巴细胞亚型是阳性(T细胞或B细胞)，同时识别特异抗体的种型(IgG或IgM)。例如，我们用FITC-conjugated anti-human-Immunoglobin、PE-conjugated CD20和Perep-conjugated CD3三色抗体，就可以同时区分出T细胞和B细胞。若受者血清上对供者CD3细胞发生反应，则表明非HLA抗体存在，因为已知HLA或排斥反应相关抗原不会只存在于T细胞。因而，这样的配型就不会成为移植禁忌证。相反，一个血清既同CD3反应，又同CD20反应，则预示至少有anti-HLAI型抗体存在。这样，FCM检测移植抗体因其同CDCXM相比更好的灵敏度而在临床有了越来越多的应用。
2. 移植后
尽管急进型和加速型抗体介导的排斥反应可以被移植前抗体检测所避免，但患者仍然面临着细胞介导的移植物排斥反应。突然的移植物功能丧失往往表明T细胞介导的急性排斥反应的发生。如果能够早期诊断，急性排斥反应往往能够成功地运用免疫抑制剂(诸如咪唑硫嘌呤、类固醇制剂等)而得到控制。因此，移植后患者免疫球蛋白的监控，就成为在移植物出现明显的损伤之前早期预测排斥反应的一个很重要的方法。几年来，科学家监测CD4(即辅助性/诱导性)和CD8(细胞毒性/抑制性)T细胞亚群来监控肾移植受体的免疫状况。早期研究表明，CD4/CD8比值同移植排斥反应有关。进而研究发现，排斥反应往往发生于CD4/CD8比值低下的患者中。然而，也有一些学者认为，CD4/CD8比值与排斥反应没有直接关系，不同的研究结果争执不下源于CD4和CD8亚群的种群多样性(Heterogenetiy)。例如：CD8可分为抑制性和细胞毒型，还有部分NK细胞亦可表达CD8抗原。同样，CD4也可根据CD29和CD45 RA的表达分为成熟型和处女型，即使是区分了各种亚型，CD4、CD8同移植排斥反应的关系仍不明显，还有待于进一步研究。
与细胞排斥反应相反，研究已经证实移植后抗体的产生预后较差，对于移植后患者的估价应综合进行，结合肌酐、尿素氮等其它临床指标，反复应用FCXM测定受者血清抗原原始供体细胞的抗体的产生。
五 流式细胞术用于血小板功能检测
流式细胞术已成为检测血小板功能状态的重要实验手段。血小板是巨核细胞分化成熟后，巨核细胞浆裂解脱落的小块细胞质，它的表面富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特异吸附的血浆成分，也是血小板粘着、聚集的反应部位。
目前认为与血小板功能有关的血小板膜糖蛋白有GPⅡb、GPⅢa、GPⅡB/Ⅲa复合物，FCM检测血小板膜糖蛋白，从分子水平诊断血小板功能和数量的异常，能灵敏地从大量血小板中检出2%阳性和阴性的血小板。
流式细胞仪检测血小板结果可以用两种方法表示：一是平均颗粒荧光强度；二是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。前者可以检测病变血小板亚群的变化；而活化状态下血小板表面GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物含量比静息时低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果，用后者就比阳性血小板百分率更合适。
流式细胞仪在检测血小板方面主要有几个方面的应用：
1. 活化血小板
(1) 活化血小板表面能通过FCM检测的标志物可分为四类：
第一类，血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白CD62、CD63在质膜上表达，成为活化血小板的标志。
第二类，血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。GPⅠb/Ⅲa(CD41/CD61)的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。GPⅣ(CD36)虽然在静息血小板上表达，但在活化血小板上表达量更高。GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上显著降低。
第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体结合的一些抗原，包括纤维蛋白原、Xa因子和Thrombospondin等，这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上是有意义的。
第四类，除免疫性分子标志物外，流式细胞仪还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。例如，用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测细胞内的Ca2+，用能进入血小板致密颗粒的燃料阿的平来检测活化血小板的释放功能。
(2)诊断学意义和临床应用
a. 大量的临床实践和研究表明，心肌缺血与血小板活化有关。心绞痛和心肌梗塞患者循环中有活化的血小板，血小板活力增强。
b. 冠状血管成形术会导致血小板活化。如血流恢复后有高水平的活化血小板，血管可能因为内皮细胞严重损伤或血小板栓塞而发生再栓塞。因此，活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性。
c. 非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化。
d. 胰岛素依赖性糖尿病、子痫前期、外周血管疾病均有血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板。
2. 血小板缺陷性疾病
GPⅠb-Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征；GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症。
3. 血小板减少性疾病
原发性血小板减少性疾病往往与免疫机制有关，血液中存在抗自身血小板的抗体，用流式细胞仪可以检测PAIg、PAIgG、PAIgM等，以判定血液中是否存在抗血小板抗体。
另外，运用噻唑橙可以检测“网织”血小板，当患者血小板计数>50000/mL，“网织”血小板可作为一个指标判断血小板减少是由破坏过多还是由于生成减少引起。
4. 血小板贮存与输注
CD62、CD63、GPⅡb/Ⅲa作为分子标志物，表现血库中贮存血有时间依赖性活化现象。贮存5天以上，40%~ 60%血小板表达活化标志CD62。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
笔者近些年应用流式细胞仪对血小板功能的基础研究和临床应用做了一些工作，下面简要介绍我们的研究成果。
(1)应用流式细胞仪检测不同诱导剂作用下的血小板钙离子浓度变化。
分别加入不同浓度的ADP、瑞斯托酶素、胶原、花生四烯酸、5-HT、凝血酶激活血小板，用流式细胞仪检测其钙离子变化，结果发现除凝血酶外，ADP等血小板激活剂均可导致血小板胞质内钙离子浓度升高，而且在一定范围内，钙离子浓度的升高幅度随激活剂的浓度升高而增加。我们没有观察到凝血酶导致血小板胞质内钙离子浓度升高。另外，我们也发现，流式细胞仪与激光共聚焦显微镜的检测数据具有较好的相关性。
(2)剪切力诱导血小板活化，应用流式细胞仪观察血小板钙离子浓度的变化。
抽取自愿者抗凝全血，制备富血小板血浆，分为四种情况对血小板进行处理：不进行剪切力作用，不加ADP；加5mM ADP，不进行剪切力作用；进行剪切力作用，不加ADP；进行剪切力作用，加5mM ADP。应用流式细胞仪方法测定血小板钙离子浓度。结果发现，不施以剪切力作用不加ADP，血小板钙离子浓度无明显变化；不施以剪切力作用而加入低浓度的ADP，血小板钙离子浓度轻微变化；高剪切力作用后即使不加ADP，发现其钙离子浓度也有明显增高；高剪切力作用后再加入低浓度的ADP，血小板钙离子浓度升高更明显；低浓度的ADP与高剪切力对血小板钙离子的增高有协同作用。
(3)应用流式细胞仪检测口服精氨酸前后血小板钙离子浓度。
选择20名至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康志愿者。志愿者口服L-精氨酸4d，每日3次，每次20g。服用精氨酸前与服药后第二天，抽取抗凝静脉血，用流式细胞仪检测加ADP激活的血小板钙离子。服用精氨酸后，以同样方法检测血小板钙离子。口服精氨酸均可抑制ADP刺激引起的血小板胞质内钙离子浓度升高。
(4)应用流式细胞仪观察服用阿司匹林前后血小板钙离子浓度的变化。
选择20名至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康志愿者，一次性口服阿司匹林0.3g。服用阿司匹林前及服药后第二天，抽取抗凝静脉血，以20mM ADP为诱导剂激活血小板，用流式细胞仪检测血小板钙离子浓度。口服阿司匹林均可抑制ADP刺激引起的血小板胞质内钙离子浓度升高。
由于钙离子浓度升高和钙波动发生于血小板活化早期，且是血小板活化的基础，所以它能敏感地反应血小板活化，我们的实践也证实，其为表示血小板活性的金指标。
(5) 应用流式细胞仪测定血小板微粒膜蛋白。
抽取自愿者静脉血，以枸橼酸钠抗凝，离心得富血小板血浆，分别以不同浓度的ADP、凝血酶、胶原作诱导剂，激活同一标本中的血小板，比较其血小板微粒表达PAC-1和CD62p的情况。结果显示：ADP、凝血酶、胶原三种激活剂作用下，激活血小板形成血小板微粒，随着激活剂浓度的增加， CD62p+ PMP、PAC-1+PMP的百分率都逐渐增加，经t检验统计分析， 同一诱导剂各浓度间有显著性差异(P<0.01)。这表明不同刺激强度的血小板诱导剂ADP、凝血酶、胶原，随着其浓度的增加，其诱导血小板所形成的CD62p+PMP、PAC-1+PMP的百分率逐渐增加。我们收集心肌梗塞、高血压病人标本，检测其血小板微粒表达PAC-1和CD62p的情况。结果发现心肌梗塞组、高血压病人组比正常对照组高，这说明心肌梗塞、高血压与血小板微粒膜上的CD62p、PAC-1表达有一定的联系，检测血小板微粒膜上的CD62p、PAC-1对两类病人预防和治疗有一定价值。我们对口服噻氯匹啶的陈旧心肌梗塞病人在服药前、服药后4d、服药后5d、服药6d、停药后3d、停药后4d进行血小板微粒表达活化糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和CD62p的检测。结果表明在心肌梗塞病人服用噻氯匹啶这一抗血小板药物的的不同时相，血小板微粒膜上的CD62p、PAC-1表达呈现一定规律的变化，检测血小板微粒膜蛋白有助于抗血小板药物疗效观察。
（全文完）
来源：《世界医疗器械》
出版日期：2006年10月
