丛玉隆 先生, 教授、主任医师、博士生导师，解放军总医院临床检验科主任，中华医学会检验学分会主任委员。
关键词: 流式细胞仪 专用型
一 专用型流式细胞仪的临床应用
为了使流式细胞术更方便、更易用于某些大批量常规项目的检测，近些年来，各类型流式法血细胞分析仪和尿有形成分分析仪问世，不但使实验结果更准确、精确，而且为临床提供了更多的实验指标，对临床的诊断和治疗有重要价值。
1. 流式法血细胞分析仪的临床应用
流式细胞术不但使红细胞、白细胞、血小板计数结果的质量较电阻法血细胞分析仪有明显的提高，也提供电阻法血细胞分析仪无法提供的新指标，较有价值的有以下几个方面：
a. 用于白细胞分类计数和白血病形态学的分型
电阻抗法白细胞“分类”只是根据加入溶血剂后，变化了的白细胞形态的大小。根据电信号进行分析。其只是根据细胞体积大小不同的特征，并未分析细胞核、细胞浆形态特点。因此只能是细胞大小的“分群”而不是分类。
流式细胞术是通过激光检测细胞，激光束可直接射入细胞，细胞的核、浆特征不同，给予的检测信号不同，因而可较准确地进行细胞分类。除此以外，有些仪器还可以分析幼稚白细胞，甚至进行白血病分型的初步分析。比如笔者研究证明ADVIA 120血细胞分析仪因为使用细胞化学和激光两种技术进行综合分析，就可以用末梢血(白血病细胞比例>70%)进行以仪器分析，根据报告的散点图，初步诊断出是淋巴细胞白血病还是髓细胞白血病。
b. 用于网织红细胞分析
前已述及，由于激光束可射入细胞内，因而可进行红细胞内容物的分析，网织红细胞浆内含有一定量的RNA，经染色后可显示网织结构且其形式与RNA含量有关。流式法血细胞分析仪根据这一原理可将网织红细胞分成三群，即早期网织红细胞(HFR)、中期网织红细胞(MFR)和晚期网织红细胞(LFR)。这三型网织红细胞比例变化，有以下临床意义：
(1)贫血的诊断和鉴别诊断。
(2)贫血的疗效观察，凡贫血治疗有效者，笔者动态观察指标变化显示HFR比率的升高可早于Hb变化3~5天，早于MCV变化5~7天。
(3)肿瘤治疗(放疗、化疗、移植)过程中，了解骨髓内造血状态。笔者研究表明HFR+MFR的比例变化，可作为了解造血状态的指标。当骨髓造血功能受抑制时，HFR+MFR比例的减低要早于周围血白细胞总数的减少；当骨髓从受抑制状态恢复时，HFR+MFR的比例升高也早于白细胞总数的变化。
(4)有些血细胞分析仪除HFR、MFR和LFR以外，还可提供网织红细胞体积(MCVr)、网织红细胞含量(CHr)、网织红细胞体积分布宽度(RDWr)和网织红细胞血红蛋白浓度(HDWr)等参数，对贫血的诊断、鉴别诊断和疗效观察有一定的意义。
c. 用于网织血小板分析
1969年Ingramhe和Coopersmith用美蓝对血小板进行染色，发现有些血小板胞浆内有粗糙的呈点状分布的网状物质，他们认为这些物质只是胞浆中残留的mRNA物质被染料着色，因而将这些血小板称为网织血小板(Reticulated Platelet，RP)。
1990年Kienast等报道利用流式细胞仪检测RP，用荧光染料噻唑橙(TO)标记RNA进行分析测定，方法与网织红细胞的FCM测定相似。但由于仪器昂贵，步骤繁琐，没能在临床常规采用。近年来，Sysmex生产的XE-2100增添了网织血小板检测功能，仅使用少量末梢血，瞬时即可得到红细胞、血小板及血小板(包括网织血小板)多项参数。
RP与网织红细胞一样，都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞，它与正常血小板相比胞浆内含有少量的mRNA，体积较大，而且有更强的活性，随着血小板的成熟，mRNA逐渐消失，体积逐渐缩小，RP能够比较精确地反映骨髓血小板生成情况，对于血小板方面疾病的诊断和治疗判断具有很好的临床意义：
(1)利用RP%和RP绝对计数结合外周血血小板计数用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和治疗效果的监测。
(2)通过RP%和RP绝对计数，用于血小板增生性疾病的鉴别诊断和发生栓塞危险性的判断。
2. 流式法尿有形成分分析仪的临床应用
尿液有形成分检查对泌尿系统疾病的诊断、鉴别诊断及疗效的评估有重要意义。显微镜检查是尿有形成分的检验的金标准。临床对检验科的需求日益增加，如此大量的标本，如何能够保证质量完成检测呢？流式法尿液分析仪在某种程度上解决了这个问题。
通过流式细胞仪检测将尿液中有形成分含量属于正常范围的人群筛出，视为正常，无需再镜检。将更多的时间用于有病理成分标本，用于细致的尿镜检。应注意尿流式的使用绝不是废弃镜检，而是为了更好地镜检。
尿流式分析仪的另一个优点是可以客观地分析均一性红细胞群和非均一型红细胞群，其比例变化对于血尿来源的鉴别诊断有一定意义。
二 流式细胞术在基础和临床医学中的应用
除上述临床常用的参数以外，流式细胞仪也用于一些临床基础研究和疾病相关的参数检测的方法学探讨。这些工作包括：
1. 流式细胞仪在细胞免疫治疗中的应用
肿瘤的细胞免疫治疗主要是通过主动或被动调动宿主天然防卫机制来取得抗肿瘤的效应。具体表现为干扰细胞生长、转化或转移的直接抗瘤作用或通过激活免疫系统的效应细胞及其所分泌的因子来达到对肿瘤杀伤或抑制的目的。在各种的实际运用中。
a. 免疫治疗的类型
(1)细胞因子技术：主要是利用外源性细胞因子输入病人体内，利用细胞因子的活性来进行免疫调节、免疫协同等作用激活机体的免疫系统来达到免疫杀伤作用。目前主要应用的有白细胞介素和干扰素，被FDA许可的有gamma-IFN、IL-4、GM-CSF、EPO等。
(2)过继性细胞免疫治疗：主要是被动输入已经感染同种肿瘤或病原的治愈病人的免疫细胞，来达到治疗患者这些疾病的目的；或利用患者体内免疫细胞，经过体外培养刺激后造成免疫细胞的活化或成熟来达到免疫杀伤功能，如CIK、DC、LAK细胞治疗等。
(3)单克隆抗体及其偶联物技术：利用单抗特异性识别肿瘤或病原抗原的性质，通过调动患者体内的主动免疫系统(免疫调节、ATCC、补体系统等)来提高机体的免疫能力，或利用抗体携带特定的药物，特异性地进入病灶部位，发挥生物导弹的作用。
(4)肿瘤疫苗技术：利用灭活的肿瘤抗原(放射性灭活、NDV病毒溶瘤作用)等来主动刺激机体的特异性免疫系统来发挥杀伤肿瘤或病原作用。
(5)基因治疗技术：利用充足的载体(如AV、AAV)等搭载非特异性治疗性细胞因子或其它蛋白，转染入机体细胞来源源不断地制造有活性的可溶性蛋白，来提高机体免疫能力。
(6)干细胞治疗技术：化疗或放疗后利用干细胞强大的再生能力来达到机体细胞恢复和功能重建的治疗目的。
b. 流式细胞仪在细胞免疫治疗中的作用和特点
(1) 主要特点有：快速检测大量目标细胞；具有检测稀有细胞的能力；多参数分析功能能精确定量无特异性标记的靶细胞。
(2)主要作用：
(a)细胞因子治疗技术：在用药剂量和疗效评估方面，利用流式细胞仪检测可能应答细胞因子的免疫细胞的数量/活化的比例，能够在治疗早期就得到第一手的信息。如检测活化的T细胞(CD4CD25)，成熟的DC(DR＋，CD80＋，CD86＋)等。
(b)过继性细胞免疫治疗：可以直接检测过继性免疫细胞的状态的数量，或病人免疫细胞经过体外培养、诱导、刺激之后活化细胞的比例和种类。目前应用最多的是检测CTL(CD3CD8)，活化的T细胞(CD4CD25/CD69/DR)，树突状细胞(DC)的细胞比例等。随着理论水平的进一步深入，抗原特异性T细胞(如乳腺癌抗原特异性四聚体反应性T细胞数量等)，都是用来评估细胞治疗疗效的重要手段。
肿瘤细胞不能及早被监测或不能被清除是病程逐渐延长和恶化的主要原因。一旦调控性T细胞(CD4+/CD25+/FOXP3+)数量或功能不足，机体免疫监控功能降低，容易对异质性抗原形成耐受，如果数量或功能过强，则容易形成自身免疫性疾病。由于调控性T细胞(CD4+/CD25+/FOXP3+)发挥的免疫调控作用为非特异性，所以临床上可以选用外源性调控性T细胞输注或病人体内淋巴细胞诱导转化后回输治疗免疫耐受。类似的过继性细胞免疫治疗应用的目标细胞还可以是CTL(CD3+/CD8+)，DC或活化的所有免疫细胞。最新的流式细胞仪在细胞免疫治疗中的作用为检测某些抗原特异性的T细胞(CD8+/Tetramer+)。可以通过检测抗原特异性的T细胞来观察和总结某一类疾病的疾病发生、发展和转归规律，甚至可以为病人输入同样疾病但痊愈的病人的抗原特异性T细胞来增强针对这种抗原的特异性免疫作用。
(c)单克隆抗体及其偶联物技术：在动物实验中利用单克隆技术标记荧光(QDOTS、CFSE)等可以清晰观察抗体和病灶结合部位和病灶清除情况，来了解用药剂量和进行抗体克隆的选择。如果单克隆抗体偶联某种药物，即为所谓的“生物导弹”，能在局部形成高药浓度，提高药物杀伤能力。目前这还处于研究阶段。
(d)肿瘤疫苗技术：疫苗的主要目的是诱发机体的主动免疫作用的增强，而流式细胞仪是观察这种增强作用的重要手段。可以计数T细胞，B细胞，NK细胞，DC等数量的变化；可以分析T细胞活性的增强(如Th1/Th2细胞因子分泌细胞的变化，CD69、CD25、CD71、DR等活化标记表达增强细胞的变化等)；肿瘤疫苗特异性免疫细胞(TETRAMER四聚体细胞的增加)。
(e)基因治疗技术：流式细胞仪在此技术从开始制备到疗效观察整个过程都能发挥重要作用。在载体转染后阳性细胞的筛选过程中，流式细胞仪能大量检测阳性细胞，提高效率，在治疗过程中同样可以观察各种免疫细胞数量和质量的变化。
(f)干细胞治疗技术：流式细胞仪能计数干细胞来源体系中干细胞的绝对数量，按照每公斤体重来指导输入的干细胞来源体系的数量，也可以区分来源中是干细胞还是祖细胞来评价来源的质量。在功能重建过程，能及早检测到血小板、白细胞等细胞数量和功能恢复的进度(血液系统肿瘤干细胞移植)。
2. 肿瘤基因表达产物的检测
(1)Myc基因族(C-myc、N-myc、L-myc)：癌基因，高表达促使转化细胞恶性繁殖，进入肿瘤临床期。
(2)Ras基因族(N-ras、K-ras、H-ras)：癌基因，编码蛋白为P21，在乳腺癌、胃癌中表现为P21蛋白过度表达。
(3)p53：抑癌基因，可抑制ras和myc基因作用引起白细胞转化，许多恶性肿瘤都有p53基因的缺失或点突变。
(4)C-erbB2基因：又称neu基因，在癌细胞表面常有表达产物为HER-2/neu，其过量表达与肿瘤的发生、复发转移及预后不良有关。
3. 用于肿瘤干细胞的检测
肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在，由于肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测，目前研究发现干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色时，能将该染料泵出而使干细胞不着色，用流式细胞仪检测此类细胞，可以帮助肿瘤干细胞的检测。目前主要在前列腺和乳腺肿瘤进行研究。
4. 用于细胞凋亡的检测
细胞凋亡与细胞坏死是个不同的过程，与凋亡病理相关的疾病主要表现在HIV、自身免疫疾病和肿瘤，应用FCM进行下列试验可发现细胞凋亡的主要表现。
(1)观察细胞内水解酶改变(Casoase-3活化)；
(2)观察细胞膜不对称改变(AnnexinⅤ/PI)；
(3)观察膜DNA的断裂改变(TUNNEL实验)；
(4)凋亡相关蛋白Fas，Bcl-2。
5. FCM在微生物学的应用
FCM的应用逐步进入微生物学，主要用于：(1)直接测定病原菌及其毒素；(2)病原体血清学诊断；(3)抗生素敏感试验(荧光素着色和强弱与被测菌活性或功能状态密切相关)；(4)细菌活性鉴定与计数(TO可以染死细胞和活细胞，PI只能染活细胞)。
6. FCM在药理学中的应用
在药理学的研究中，FCM主要用于：(1)多重抗药性(MDR)；(2)化疗药物作用机制及疗效评价；(3)P170多药耐药基因；(4)谷胱甘肽转移酶。
7. FCM在细胞生物学的应用
在细胞生物学研究中，FCM主要用于：(1)细胞周期分析(cyclin系列)；(2)胞内钙离子浓度测定；(3)脑内pH值测量；(4)细胞增殖(PCNA)。
（全文完）
来源：《世界医疗器械》
出版日期：2006年11月
