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加强临床流式细胞免疫表型分析的质量控制
王建中
流式细胞术(ＦＣＭ)的应用越来越广泛,流式细胞免疫表型分析已经成为最常用的检查项目。ＦＣＭ可以通过多参数分析异质性细胞群的免疫表型,从双参数分析外周血细胞到参数以上分析骨髓细胞膜、细胞浆和细胞核等多种抗原成分,涉及临床多种疾病的诊断、治疗与预后等诸方面。白血病和淋巴瘤的免疫表型分析、微小残留白血病细胞的免疫检测是血液肿瘤的形态学诊断与监测的重要补充和深化;血液淋巴细胞免疫表型分析与免疫细胞亚群绝对计数是评价机体免疫功能、诊断与监测免疫性疾病的重要手段;精确计数外周血造血干/祖细胞的数量,是判断最佳采集时机、成功进行造血干细胞移植的关键;血小板免疫表型分析和免疫性血小板计数对出血与血栓性疾病的诊断与治疗有决定性作用;血液中Ｔ淋巴细胞膜ＨＬＡ Ｂ27表达的精确定量是诊断强直性脊柱炎的重要指标。然而,免疫表型分析结果存在多种影响因素,包括样本与试剂准备、单克隆抗体(ＭｏＡｂ)、免疫荧光染色方法、对照设置、流式细胞仪校准、流式细胞数据的获取与分析等。只有充分了解这些影响因素并做好严格的质量控制,才能保证其试验结果的准确、可靠,且具有临床应用价值。
一、 样本与试剂准备免疫表型分析的样本如血液、骨髓、体液等必须当天采集,6ｈ之内进行免疫荧光染色;特殊试验,如循环活化血小板检测应在采血后立即染色与固定。所使用的抗凝剂、缓冲液、溶血剂、固定剂等必须符合标准,如血液、骨髓的抗凝采集管,最好使用ＥＤＴＡ Ｋ2或枸橼酸钠真空采血管。用于稀释、洗涤细胞的缓冲液应经<0 2μｍ孔径的滤膜过滤,并含有0 1%的牛血清白蛋白,减少颗粒的干扰和对单克隆抗体的非特异性吸附。组织样本应去除聚集并过滤、制备单细胞悬液,不应用进行酶消化和乙醇固定,避免破坏或改变抗原结构,可采用机械法去聚集,目前广泛使用的单细胞制备仪(ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ)最适合组织细胞的去聚集。红细胞溶解液(溶血剂)最好使用在国内外广泛应用的试剂(如美国ＢＤ公司的ＦＡＣＳＬｙｓｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ),因为经不同种类的溶血剂作用的白细胞对ＭｏＡｂ的结合及光散射特性有显著差别,对免疫细胞亚群(如淋巴细胞亚群)计数的参考范围也不同。ＭｏＡｂ与细胞的结合依赖于两者合适的比例,细胞过多或抗体浓度过低、过高都可影响免疫表型分析。分析血液细胞免疫表型时,应计数血液白细胞数量。当ＷＢＣ<1000/μｌ时,用200μｌ血标本、加溶血剂4ｍｌ(ＦＡＣＳＬｙｓｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ)、ＭｏＡｂ20μｌ(ＢＤＭｏＡｂ);ＷＢＣ在1000～10000/μｌ,用100μｌ血标本、加溶血剂2ｍｌ、ＭｏＡｂ20μｌ;ＷＢＣ在10000～20000/μｌ,用50μｌ血标本、加溶血剂1ｍｌ、ＭｏＡｂ20μｌ;ＷＢＣ>20000/μｌ,血液应用磷酸盐缓冲液稀释至1000～10000/μｌ,用稀释血100μｌ、加溶血剂1ｍｌ、ＭｏＡｂ20μｌ。
二、单克隆抗体1 特异性:ＭｏＡｂ的特异性应该通过识别正确的靶抗原进行定义。ＭｏＡｂ的特异性多是由制造商在其产品说明书上列出,但应注意所列ＭｏＡｂ的细胞克隆是否为国际白细胞分化抗原鉴定会议通过。对于白血病和淋巴瘤的免疫分型、结果的解释应与形态学的“金标准”和临床表现比较,每个实验室应该建立所用ＭｏＡｂ的流式细胞术分析偏差的期望值,一般<5%。然而,ＭｏＡｂ属于“自制”试剂,随着每个实验室的方法不同可能
存在正常或异常细胞诊断特异性方面的差异。临床血液病学检查的标本几乎总是正常细胞伴随着异常细胞,因此在1份标本中能够同时评价两类细胞,只有正常细胞的免疫表型正确时,异常细胞的免疫表型结果才是可靠的。2 灵敏度:是指与非特异性或阴性对照染色相比,能够被流式细胞仪检出的最低荧光染色强度。灵敏度依赖于ＭｏＡｂ的滴度、ＭｏＡｂ与细胞的比例、合适的仪器设置和校准等。应了解每一种ＭｏＡｂ的灵敏度。3 精密度:用ＭｏＡｂ检测单一样本,重复测定20次以上。正常外周血、骨髓、培养细胞系和质控物(如美国ＢＤ公司的ＣＤＣｈｅｘ等)可用于精密度测定。对每一种ＭｏＡｂ应测定其均数和标准差,作为ＭｏＡｂ每次应用时的参考。4 适用范围:商品化的ＭｏＡｂ一般都标明其适用范围。按用途可分为3类:体外诊断(ｉｎｖｉｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ,Ｉ
ＶＤ)试剂、分析特异性试剂(ａｎａｌｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ,ＡＳＲ)和仅供研究用(ｏｎｌｙｒｅｓｅａｒｃｈ)试剂。作为临床应用的ＭｏＡｂ,建议尽可能使用ＩＶＤ和ＡＳＲ试剂,尤其是对临床具有诊断或治疗意义的试验,如白血病与淋巴瘤的免疫分型、血液淋巴细胞免疫表型分析与免疫细胞亚群绝对计数、外周血造血干/祖细胞计数、淋巴细胞ＨＬＡ Ｂ27定量分析等。
三、免疫荧光染色方法依据分析目的不同选用,间接免疫荧光染色已较少,直接免疫荧光染色包括单色～四色分析,二色以上分析较为常用;现已可达十色分析,但临床尚未应用。单色免疫荧光多用于ＭｏＡｂ特异性较高、单一细胞群的抗原检测,如红细胞膜ＣＤ55或ＣＤ59测定。血液淋巴细胞免疫表型至少应用双色分析,白血病与淋巴瘤的
免疫分型、淋巴细胞免疫亚群绝对计数、造血干/祖细胞计数等复杂免疫表型宜采用三色或四色分析。在多色免疫表型分析的荧光素标记ＭｏＡｂ组合时,应注意不同ＭｏＡｂ彼此间有无干扰,最好采用同一品牌的试剂,因为不同品牌的荧光素标记ＭｏＡｂ的生产工艺和标记的荧光色素等有差异,可干扰免疫反应和影响流式细胞仪测定时的颜色补偿,产生假阳性或假阴性结果。组合的多色标记ＭｏＡｂ可以从厂商购买,也可由本实验室制备,但组合的多色标记ＭｏＡｂ的荧光信噪比、对靶细胞的结合强度应该与未组合时相同。血液或骨髓免疫荧光染色后的溶血处理,溶血免洗一般用于细胞绝对计数,其他的免疫表型分析应尽可能溶血后洗涤1次,减少红细胞碎片的干扰。
四、对照设置流式细胞术分析免疫表型必须设置各种对照(ｃｏｎｔｒｏｌｓ),包括阳性对照(ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｎｔｒｏｌ)、阴性对照(ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ)、正常对照(ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ)、同型对照(ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ)、空白对照(ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ)等。对照的目的是避免各种因素可能造成的假阳性或假阴性反应。1 阳性对照:是检查已知阳性标本能否用所测条件与方法确定为阳性,如ＣＤ3的ＭｏＡｂ检测正常人血液Ｔ淋巴细胞的阳性率一般应大于60%以上,若明显低于此值,则有可能是ＭｏＡｂ的质量与浓度、荧光染色条件、流式细胞仪的状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能进行临床试验。2 同型对照:是指与ＭｏＡｂ相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如ＩｇＧ1 ＦＩＴＣ、ＩｇＧ2ａ ＰＥ等。主要考虑了细胞的自发荧光、ＦＣ受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与ＭｏＡｂ所标记的荧光色素、浓度、Ｆ:Ｐ比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为最佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与ＭｏＡｂ不相匹配的同型对照,最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备(如同一品牌)的产品。3 空白对照:仅以缓冲溶液,如ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ缓冲液等替代ＭｏＡｂ进行试验,其余条件与阳性或同型对照相同。空白对照主要用于观察细胞和缓冲液中所含物质的自发荧光。由于一般标本细胞的自发荧光极弱,又已做同型对照,免疫表型分析时可以免做空白对照。4 正常对照:用健康人、近期无感染、未使用任何药物的标本(如血液)作为对照。对一种新的ＭｏＡｂ(如Ｃ
Ｄ19 ＦＩＴＣ),在使用前进行对照试验,可了解其性质、效价等特性是否符合实验要求。在临床试验时,为了避免
一些不定因素可能造成对实验结果的的影响,以及与患者测定结果比较,常常需要正常对照。例如,正常对照血小板ＣＤ41阳性百分比应至少>95%以上,平均荧光强度(ＭＦＩ)比同型对照强5～10倍以上,若正常对照出现异常结果,则不能出实验报告。5 阴性对照:是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测,应出现阴性结果的对照试验。阴性对照试验可以避免ＭｏＡｂ的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。如血小板无力症(Ｉ型)患者,由于其血小板缺乏ＣＤ41和ＣＤ61,可作为最好的阴性对照。测定血小板膜ＣＤ41时,方法同正常对照,只是将正常人血液替换为血小板无力症患者,血小板无力症Ｉ型患者血小板膜ＣＤ41阳性血小板百分比一般<5%。6 自身对照:待测标本为混合细胞(如血液或骨髓)时,若检测其中一种细胞的免疫表型,则其他细胞可作为对照。例如,测定外周血中白血病细胞的髓过氧化物酶(ＭＰＯ),白血病细胞为阴性,成熟中性粒细胞应呈阳性(阳性对照),成熟淋巴细胞为阴性(阴性对照),可以准确地判断白血病细胞ＭＰＯ为阴性。此种自身对照可能比外加阴性对照或阳性对照更可靠,尤其是在细胞内抗原分析时更是如此。
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