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应重视细菌药物敏感试验的质量控制
马越 李景云 金少鸿 作者单位:100050北京,中国药品生物制品检定所国家细菌耐药
性监测中心
在各种体外细菌药物敏感试验(以下简称药敏试验)中,纸片扩散法由于操作简单,价格便宜,是普通
临床微生物实验室最为常规的方法[1,2]。在国内文献中,所采用的纸片扩散法均根据美国临床实验室
标准委员会(ＮＣＣＬＳ)制订的标准试验方法(Ｋ Ｂ法)和判定标准。很多因素会影响纸片扩散法的结果
,因此,质控对于保证药敏试验的质量和可靠性是必需的。质控分为室内质控和室间质控,常规室内质控是通过测试质控菌作为主要的质量保证程序,用于确保试验过程准确、试剂可靠和操作正确;室间质控对提高菌种鉴定和药敏试验结果的准确性提供了帮助。本文就纸片扩散法中的质控问题加以阐述,以提高国内细菌耐药性监测水平。
1.质控菌株:纸片扩散法中,最常用的质控菌株为大肠埃希菌ＡＴＣＣ25922、金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ25923和铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ27853。它们均为敏感质控菌株。在进行特殊的药敏试验时,耐药菌株也常被用作质控菌。上述质控菌种可以在中国医学细菌保藏中心和国家细菌耐药性监测中心获得。菌种可用推荐肉水加15%甘油和脱纤维羊血或兔血冻存于-20℃或-70℃冰箱[1]。试验用普通质控菌种可保存于营养琼脂斜面,苛养菌保存于巧克力琼
脂斜面,存于4～8℃。试验前对菌种进行传代培养,质控试验必须使用18～24ｈ的新鲜培养物。每周应从冻存于低温冰箱中的肉水中获得新鲜培养物,以防止质控菌的变异。一旦发现质控菌株污染或存在问题,则应立即更换。对于从患者分离菌株的药敏试验,使用敏感的质控菌株并不能保证所有结果都正确[2]。肺炎链球菌ＡＴＣＣ49619是一株青霉素中介耐药的菌株,在检测对青霉素敏感性降低的肺炎链球菌时作为质控菌。粪肠球菌ＡＴＣＣ51299是
高浓度庆大霉素和链霉素的耐药株,用于检测肠球菌对高浓度庆大霉素和链霉素耐药性。
2.质控菌试验结果控制:理论上常规质控菌株对常用抗生素的药敏试验应该每日进行,正确测量其抑菌圈直径并加以记录。理想的结果是抑菌圈直径在质控范围的中间部位。一个抗生素的药敏试验偶尔偏离了质控范围并非必需要采取什么措施,除非其结果远离质控范围。接连2次偏离质控范围时,可能表明药敏试验出现了问题。特别当对几种抗生素同时出现这种现象时尤其应该注意。这时需认真检查试验方法,包括平板的厚度,菌液涂抹和加药敏纸片及放入培养箱的间隔时间,培养条件等。如果连续30次的质控结果用均值±2倍的标准差作为参考范围,常出现的情况有以下3种[3]:(1)偶尔一个质控结果偏离了上述要求,这可能预示将要出现问题。如果未发现试验中的其他问题,当日的结果是可以考虑使用的。(2)如果连续2次结果偏离质控范围,且在同一方向(即均在质控范围的上方或
下方),可能是实验中出现问题,应对整个操作过程和实验耗材进行审查。(3)连续10次的质控结果虽然在范围内,但均在均值的同一侧。这结果当然是可以接受的,但可能存在系统偏差,需加以校正。将药敏实验的质控的结果输入ＷＨＯＮＥＴ软件中,可以很容易观察质控菌株对试验用抗生素的结果,这样便于发现偏离质控范围的数据,并可以推测抑菌圈变化的趋势。实际上,在普通临床微生物实验室是根据ＮＣＣＬＳ的建议[4],连续20次试验未发现2次或2次以上偏离质控范围时,室内质量控有95%的可信性。应当注意的是,如果任何一周的质控结果出现偏离,需立刻采取措施,短期增加药敏实验次数,查找错误原因。
3.培养基的控制:Ｍｕｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ琼脂是纸片法药敏试验的常规用培养基。当购入新批号的培养基后
,应检验其与以前用的是否相似。方法是将新、老批号培养基在相同的条件下同时进行试验。除普通质控菌外,还应包括苛养质控菌。新批号的培养基的检测应包括全部常用抗生素[3]。抑菌圈直径偏离质控范围,可能表明新批号的培养基存在问题。ｐＨ过高会使四环素的抑菌圈变小,而氨基糖苷类抗生素的抑菌圈增大,相反的现象则表明ｐＨ过低。新批号的培养基只有在获得满意的检测结果后方能投入使用,这样才能保证前、后药敏结果的可比性。琼脂平板的薄、厚直接影响抑菌圈的大小。
4.药敏纸片的质量控制:纸片扩散法中的药敏纸片应注意保存,常规用量之外的药敏实验纸片最好在-20℃保存。纸片保存应用过程中应注意有些药敏纸片如某些喹诺酮对光不稳定。应注意避光保存。含有β 内酰胺酶抑制剂和亚胺培南的纸片怕潮湿,应加入干燥剂保存。质控试验中纸片周围抑菌圈直径的减小,可能是抗生素的降解所致,因此,要注意更换新的药敏纸片。对于含β 内酰胺酶抑制剂的纸片,应用产β 内酰胺酶的大肠埃希菌ＡＴＣＣ35218来进行检测[1,3],观察抑菌圈直径是否由于抑制剂的降解而减小。药敏纸片应在药敏试验前从低温保存处取出,纸片达到室温时再使用。由于偶然存在有纸片抗生素浓度的片间差问题,所以一旦发现此现象,应及时更换新批次的药敏纸片。另外,可能有些纸片并不经常使用,特别是对规模较小的实验室来讲,应注意纸片的使用期限,不要使用过期的纸片。
5.接种菌量的控制:对于任何细菌的药敏试验,适当浓度的接种菌量都是得到正确结果的基本保证。接种量的过多[5]和过少,在药敏试验中都是较为常见的问题。使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度来确定菌悬液浓度是最为精确的方法。国家细菌耐药性监测网的三级甲等医院的微生物实验室绝大多数用此来确定药敏试验的接种量;部分中小实验室则采用麦氏比浊法。无论如何,无标准参照物而仅凭经验是很难保证接种菌悬液浓度的准确性。使用自配麦氏比浊管的实验室,应经常更换新的比浊管。
6.其他问题:标准90ｍｍ的平板不要多于6个药敏纸片,否则会使抑菌圈边缘交叉,结果不易判读。所有药敏纸片的抑菌圈直径过大和过小,可能与培养基的厚度和接种量多少有关。同时,应确保在菌悬液涂抹后15ｍｉｎ内加完纸片,加完纸片后15ｍｉｎ内送去培养。根据ＮＣＣＬＳ的要求,满足培养条件和时间,才能准确读取药敏结果。如肠球菌对万古霉素和葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验应在培养满24ｈ后观察结果,才不至于漏检那些生长较缓慢的
异质性耐药菌株。因ＮＣＣＬＳ标准每年更新版本,其中对质控菌株的判定标准也有部分改变,如大肠埃希菌ＡＴＣＣ25922对头孢吡肟的抑菌圈直径从2001年的29～35ｍｍ改变为2002年的31～37ｍｍ[6]。只有对新标准了解和熟悉,才能保证质控工作的顺利开展。
7.室间质控活动:由参考实验室组织,定期发放菌种给各参加实验室,用以检测实验室菌种鉴定和药敏试验能力的质量评定活动,是考核一个实验室真正水平的手段。有条件的实验室应多参加室间质量评价(包括不同类别的室间质量控制),拓展信息来源,矫正实验室工作中的不足。世界卫生组织和美国疾病控制预防中心组织的药敏试验外质评(
ＷＨＯ ＥＱＡＳ)是目前国际间最大的质控活动,包括40几个国家300多个实验室参加;在中国,这项活动由国家细菌耐药性监测中心组织实施。
参考文献1ＢａｒｒｙＡＬ,ＴｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙＣ.Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓ:ｄｉｆｆｕｓｉｏｎｔｅｓｔｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ.Ｉｎ:ＭｕｒｒａｙＰＲ,ＢａｒｏｎＥＪ,ＰｆａｌｉｅｒＭＡ.ｅｔａｌ.ＭａｎｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,7ｔｈｅｄ.ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,1999,978 989.2ＡｎｄｒｅｗｓＪＭ.ＦｏｒｔｈｅＢＳＡＣｗｏｒｋｉｎｇｐａｒｔｙｏｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｔｉｎｇ.ＢＳＡＣｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｄｉｓｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ.ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒ,2001,48(Ｓｕｐｐｌ)1:43 57.3ＫｉｎｇＡ,ＢｒｏｗｎＤＦＪ.Ｑｕａｌｉｔｙａｓｓｕｒａｎｃｅｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｂｙｄｉｓｃｄｉｆｆｕｓｉｏｎ.ＪＡｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒ,2001,48(Ｓｕｐｐｌ)Ｓ1:71 76.4ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ.Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓ7ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ:ＡｐｐｒｏｖｅｄＳｔａｎｄａｒｄＭ2 Ａ7:ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ,Ｗａｙｎｅ,ｐａ,2000.1.5ＴｅｎｏｖｅｒＦＣ,ＭｏｈａｍｍｅｄＭＪ,ＳｔｅｌｌｉｎｇＪ,ｅｔａｌ.Ａｂｉｌｉｔｙｏｆｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｔｏｄｅｔｅｃｔｅｍｅｒｇｉｎｇａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ:ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙｔｅｓｔｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｈｅＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ’ｓｅｘｔｅｒｎａｌｑｕａｌｉｔｙａｓｓｕｒａｎｃｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ.ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ,2001,39:241 250.6ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ.Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓ12ｔｈｅｄｉｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ,Ｍ2 Ａ.2001,1 | 
