2 LDL-C的测定方法
2.1 概述 测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等,应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开,然后测定LDL组分中胆固醇含量。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。CDC测定LDL-C暂定的参考方法为超速离心法(β-定量法/BQ法),也为NCEP所推荐。此法测定的LDL-C,实际上包括脂蛋白(a)[Lp(a)]和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量,也是评价其他检测方法准确性的基础。此法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高,不易在普通实验室开展。Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法,被NCEP推荐为常规测定方法。其以VLDL组成恒定(VLDL-C/TG =0.2,均以mg/dl计)的假设为前提,具有简便、直接、快速等优点。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响,总变异可达9.5%。但在血清中存在CM、血清TG>4.52mmol/L (400mg/dl)、血清中存在异常β脂蛋白时[Ⅲ型高脂血症(HLP)]时不宜采用Friedewald公式法计算。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用,多用于脂蛋白的研究。 国外将临床常规实验室直接分离测定LDL-C的方法分为3代。第1代为化学沉淀法,常用方法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等。这类方法主要缺点是TG水平较高(>4.52mmol/L)时,有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。第2代方法有两类:一类为免疫分离法(immunoseparation method),美国Genzyme Diagnostics和Sigma Diagnostics公司已有可供临床应用的直接测定LDL-C商品试剂盒。即用PEG和结合有羊抗人apoE、apoAI多克隆抗体的胶乳珠分离试剂除去HDL(含apoAI/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAI/E),直接进行LDL-C测定水平。此法精密度好,准确度高,特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与β-定量法有较好相关性,不受高TG水平的影响,可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管,试剂成本较高,难以自动化,且不适于冰冻或冻干标本的测定。可用于TG>4.52mmol/L的少数患者LDL-C的检测,对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。 另一类为简便的磁珠肝素分离法(美国Reference Diagnostics公司试剂),此方法不需离心,操作简便,精密度高,与Friedewald公式法相关性好,与β-定量法结果一致。但此法所需标本量大,需特殊装置,特异性稍差,实验室较少应用此试剂盒。第3代为匀相测定法,标本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面都可达到NCEP 的分析目标。国内也可分为3代,但与国外有些不同。国内第1代为电泳法;第2代为Friedewald公式计算法与化学沉淀法,1995年中华医学会检验学会在国内推荐此法作为LDL-C测定的常规方法;第3代为目前广泛使用的匀相测定法。 2.2 匀相测定法 2.2.1 表面活性剂清除法(surfactant LDL-C assay,SUR法) 日本第一化学、Genzyme Diagnostics公司的LDL-C试剂盒均属此类方法,是国内外目前使用最广泛的一类试剂。试剂1中的表面活性剂 1能改变LDL以外的脂蛋白(HDL、CM和VLDL等)结构并解离,所释放出来的微粒化胆固醇分子与胆固醇酶试剂反应,产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色,此时LDL颗粒仍是完整的。加试剂2(含表面活性剂2和偶联剂DSBmT),它可使LDL颗粒解离释放胆固醇,参与Trinder反应而显色,因其他脂蛋白的胆固醇分子已除去,色泽深浅与LDL-C量呈比例。主要反应式如下: 2.2.2. 过氧化氢酶清除法(catalase LDL-C assay,CAT法) 以日本Denka Seiken公司、英国RANDOX 公司和美国Polymedco公司试剂盒为代表。其原理为:第一步反应中,具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL、HDL,所释放出的胆固醇在CHER和CHOD的催化反应下生成H2O2,H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步,在另一表面活性剂的作用下,LDL颗粒中的胆固醇被释放出来,并与胆固醇酶试剂反应,用标准Trinder反应即可测定LDL-C。其试剂2中所含叠氮钠可抑制第二步反应中过氧化氢酶活性。此法在第一步反应中可除去非LDL颗粒的潜在干扰,试剂中特有的表面活性剂可减少高胆红素和高TG时对测定结果的影响。主要反应式如下: 2.2.3 杯芳烃法(calixarene LDL-C assay,CAL法) 为日本国际试药公司新近研制开发的一种检测试剂,尚未在全球市场广泛销售。其原理为:第一步反应中,试剂1中所含的表面活性剂杯芳烃(calixarene)可将LDL转换成可溶性LDL-杯芳烃复合物,血清中CM、VLDL、HDL颗粒中的胆固醇在CHER、CHOD的催化反应下,与肼作用生成胆甾烯酮腙。第二步,试剂2中的脱氧胆酸盐将可溶性LDL-杯芳烃复合物打破,LDL颗粒中的胆固醇被释放出来,并在β-NAD存在的情况下与CHER、胆固醇脱氢酶反应,生成胆甾烯酮腙和β-NADH,通过测定β-NADH的变化即可测出LDL-C含量。主要反应式如下: 2.2.4 可溶性反应法(solubilization LDL-C assay,SOL法) 此类试剂以日本协和公司和Roche公司为代表。试剂1含a-环糊精硫酸盐、硫酸葡聚糖(DS 500)、MgCl2和EMSE,试剂2中含CHER、CHOD、POD、4-AAP和多聚物聚氧化乙烯-聚氧化丙烯封闭共聚多醚(POE-POP)。a-环糊精硫酸盐在少量DS及Mg2+存在下,POE-POP可减少CM和VLDL组分中的胆固醇与酶试剂的反应。可减少HDL组分胆固醇的反应。两者结合则可选择性地测定LDL-C。主要反应式如下: 2.5 保护性试剂法(protecting reagent LDL-C assay,PRO法) 以日本和光公司和美国 Sigma Diagnostics公司试剂为代表。其原理是:第一步试剂1中含CHER、CHOD、过氧化氢酶、多聚阴离子和两性表面活性剂,后者可选择性保护LDL,防止其与胆固醇酶试剂反应。非LDL-C与CHER和CHOD的催化反应生成H2O2,H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步,在另一非离子表面活性剂的作用下,LDL颗粒中的胆固醇被释放出来,并与胆固醇酶试剂反应,用Trinder反应即可测定LDL-C。主要反应式如下: 3 对匀相测定法的技术要求 3.1 对HDL-C测定的要求 3.1.1 对HDL-C测定而言,同一反应原理会有不同的试剂配方,而且这些配方也在不断地改进,还会不断涌现出新的方法与试剂。采用通过CDC CRMLN验证认可的匀相测定法试剂,使HDL-C临床测定更加便利、更加准确。常规应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定,根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1:100~1:150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。 3.1.2 由于目前尚无HDL-C测定的决定性方法及1级参考材料,使HDL-C 标准化工作难度加大。CDC-NHLBI的标准化程序对HDL-C检测的可接受限的目标进行了规定。要求检测准确度在CDC参考值(RV)的±10%以内,在小于1.03mmol/L(40mg/dl)、1.03~1.55mmol/L(40~60mg/dl)、大于1.55mmol/dl(60mg/dl)浓度范围内,HDL-C检测的最大不精密度(用标准差s表示)分别为0.065mmol/L(2.5mg/dl)、0.078mmol/L(3.0mg/dl)、0.090 mmol/L(3.5mg/dl)。NCEP1998年后目标定为总误差≤13%;不精密度要求HDL-C≥ 1.09mmol/L(42mg/dl)时,CV≤4%;<1.09mmol/L时,s≤0.044mmol/L(1.7mg/dl)。不准确度要求偏差≤±5%。应用匀相测定试剂时还应注意以下问题:试剂盒配套用校准品应准确定值,采用CDC RM法进行准确性转移;校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。特异性要高,高LDL-C, 高VLDL-C对测定结果基本无明显影响,回收率为90%~110%。最小检测水平至少为0.01mmol/L,线性上限至少可达2.59mmol/L(100mg/dl)。抗干扰能力应为:TG<5.65mmol/L(500mg/dl)、胆红素<513μmol/L(30mg/dl)、Hb<5g/L 时,对测定结果基本无干扰。采用参考方法或CRMLN DCM法进行方法学比较,相关系数r在0.95以上。未开封的试剂盒在2℃~8℃至少稳定6个月,开封后至少可保存1个月。 3.2 对LDL-C测定的要求 3.2.1 近年来相继报道一些新的匀相测定法检测LDL-C的试剂,并通过CDC CRMLN验证认可,使得LDL-C的临床常规测定更加方便,准确。临床应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定,根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1:100~1:150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。 3.2.2 目前国内外尚无LDL-C测定的决定性方法与1级参考材料,NCEP推荐CDC的β-定量法为参考方法,2级参考材料为CDC冰冻血清(NIST SRM 1951a,CAP RM 026)。NCEP暂推荐CDC的β-定量法为参考方法,Friedewald公式法为常规方法。1995年开始我国根据国内实际情况,在广大临床实验室中广泛推广化学沉淀法(如PVS法)直接测定LDL-C,这样可防止临床应用中因测定结果不准确而造成的混乱。近年来各种匀相测定法试剂因简便、快速,精密度高,易于自动化而为广大临床实验室所接受。应用匀相测定试剂时还应注意以下问题:试剂盒配套用校准品应准确定值,采用CDC RM法进行准确性转移;校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。NCEP对LDL-C测定的分析目标进行了规定,要求总误差≤12%;不精密度要求CV≤4%,不准确度要求偏差≤4%(与β-定量法测定参考值比较) 。与参考方法或CRMLN DCM法进行方法学比较结果应基本一致(相关系数r在0.95以上)。特异性要好,高HDL-C、VLDL-C对测定基本无明显影响,回收率为90%~110%。线性范围要宽,最小检测水平至少为0.01mmol/L,检测上限至少为7.77mmol/L(300mg/dl)。抗干扰能力强:TG<5.65mmol/L(500mg/dl)、胆红素<513μmol/L(30mg/dl)、血红蛋白<5g/L时,对测定结果基本无干扰。未开封的试剂盒在2℃~8℃至少稳定6个月,开封后至少可保存1个月。 参考文献 1. 鄢盛恺, 林其燧. 高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及标准化研究进展. 中华医学检验杂志,1998,21: 19-22 . 2. 鄢盛恺, 宋耀虹.低密度脂蛋白胆固醇的检测方法与标准化研究.中华医学检验杂志,1998,21:328-331. 3. 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