[转帖]光学分子影像学——第一讲 光学分子成像概述

光学分子影像学——第一讲 光学分子成像概述
申宝忠

 

 
 

申宝忠先生，教授，博士生导师，哈尔滨医科大学附属第四医院院长兼影像中心主任，全国高等医学影像教育研究会副理事长，中华医学会放射学会委员、磁共振学组副组长，美国分子影像学会会员，黑龙江省放射学会主任委员。

关键词：光学分子成像原理  光学分子成像特点

一  光学的相关基础知识

1. 光的电磁波谱

　　光是一种可以引起视觉、具有波粒二象性的电磁波，既有波动性，又具有粒子性。整个电磁波谱按波长可分一下几段(表1)：
　　只有波长范围很窄的一段才能引起视觉，称为光(可见光)，其中，红光波长最长，范围为620~760 nm，紫光最短，范围为400~430 nm。

2. 光的传播特性

　　光在同一均匀介质中是沿直线传播的，而在非均匀介质中传播方向要发生改变。光子在生物组织内的传输过程中，会受到吸收和散射的影响。当与光子频率相关的能量与在组织内过渡态的能量相匹配时，这些光子的能量就被吸收，而总光子的能量就减少了。当光射入到组织的原子上面时会发生散射，这就导致原子的电荷加速并向不同方向放射，因而导致光偏离最初的路线。因此，光波在组织内穿过时，要同时经历吸收和散射，且吸收和散射程度依赖于波长和穿透深度。

3. 荧光

　　在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。
　　事实上，荧光是指这样一种发光，当一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光，停止能量供给，发光亦瞬间停止(持续10-8~10-7s)。所以，当一定波长的光照射到荧光物质上时，会激发出波长更长的荧光，产生的荧光波长要比激发光波长长50~150 nm。而用特定波长的红光激发荧光染料，就可使其发出波长长于激发光的近红外荧光。如果把荧光分子与人体内与生理功能有关的蛋白或生物大分子结合，在体外激发荧光，并检测荧光信号，就能对人体进行分子水平的研究，这种荧光分子被称作荧光探针(Fluorescent Probe)，其基因为荧光分子基因，也就是光学分子成像的报告基因。为了能在体检测人体组织内的信息，荧光必须能穿透几厘米以上厚的组织。但是，光波在生物组织内传输时会同时受到吸收和散射的影响而产生衰减，因此有些学者对波长在近红外区域内的荧光更感兴趣，因为人体对近红外波段的光衰减最小，这样达到体表可被检测到的荧光信号强度较大，检测的难度降低，有利于定量研究。

二  光学分子成像原理

　　光学分子成像是在基因组学、蛋白质组学和现代光学成像技术的基础上发展起来的新兴研究领域。
　　传统的光学成像方法依托于可见光成像，如内镜成像技术。内镜(胃镜、肠镜等)成像技术是利用具有韧性的导管通过人工切口或天然的开口进入体内进行检查，简便、易行，但只能观察到内部结构的表面部分，而且光线在穿透组织的过程中，会在组织的表面发生广泛的反射和散射现象，导致处在阴影部分的结构模糊不清，不能识别。
　　新型的光学分子成像技术则依托于非可见光成像，通过向体内引入荧光物质或基因可以检测到在组织表面之下一定范围内的区域，使显像深度更进一步。
　　光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。光学分子成像就是基于对穿过生物组织的光子的光学信息(强度、光谱、寿命、偏振)探测的基础上，通过引入合适的荧光探针，用特定波长的红光激发荧光染料，使其发出荧光，或通过引入某些报告基因，其表达产物可自发产生荧光，而出射光中携带着与吸收和散射相关的组织生化信息，通过光学成像设备可以检测发射出的荧光并充分挖掘和利用这些光学信息定量的研究荧光分子的分布，从而直接记录和显示分子事件及其动力学过程，这就是光学分子成像的基本原理。
　　目前，活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光(Bioluminescence)与荧光(Fluorescence)两种技术。
　　生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA。目前应用较多的报告基因是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)基因，其基因表达产物萤火虫素酶可以和从体外导入的萤火虫素(Luciferin)发生反应而发出近红外荧光，并可被CCD相机捕获。
　　荧光技术则采用荧光报告基团(如GFP、RFP 、dyes、Cyt等)标记细胞或DNA。目前应用较多的报告基因是绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因，其表达后产生的绿色荧光蛋白，在体外激发光激发下发出荧光，也可被CCD相机捕获。
　　近红外荧光成像不涉及报告基因，它的成像探针包括非特异性荧光探针(如dyes)和特异性荧光探针(如Cyt)。近红外荧光成像就是以合适的荧光探针作为标记物，用特定波长的红光激发荧光染料，使其发出波长长于激发光的近红外荧光，应用近红外线光学成像设备进行检测。该技术在肿瘤检测、基因表达、蛋白质分子检测和药物受体定位等方面有着很大的应用潜力。
　　目前应用于近红外线光学成像的设备很多，包括光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography，OCT)、激光斑点成像(Laser Speckle Imaging)、偏振光成像(Polariza-tion Imaging)、反射荧光成像(Fluorescence Reflectance Imaging，FRI)、弥散光成像(Diffuse Op-tical Tomography，DOT)、荧光共振成像(Fluorescence Resonance Imaging)、荧光介导的分子断层成像(Fluorescence Molecular Tomog-raphy，FMT)等。

三  光学分子成像的应用范畴

　　光学分子成像作为近年来新兴的活体动物光学成像技术，以其操作简便及直观性成为研究小动物活体成像的一种理想方法，在生命科学研究中得以不断发展。利用这种成像技术，可以直接、实时地观察标记的基因、分子及细胞在活体动物体内的活动及反应。通过光学分子成像，利用灵敏的光学检测仪器，可以直接检测活体生物体内的动态代谢过程，探测蛋白酶、蛋白质和酶的活动，探测活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这些技术，还可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、疾病的发生发展、特定基因的表达等生物学过程。利用光学标记的转基因动物模型可以研究疾病的发生发展过程，以及药物的研究及筛选等。
　　随着光学分子成像技术的发展，近红外检测的深度已从体表(如皮肤)发展到浅层组织(如肌肉、脂肪、口腔、新生儿脑组织)、深层组织(成人脑组织、心脏、骨路)，甚至到整个人体(如胸腔)，为光学分子成像进入临床应用提供了可能。临床前实验研究已经证实：肿瘤组织发出的近红外荧光可以穿透12 cm的乳腺组织或肺组织、6 cm的肌肉组织、5 cm的成人脑组织。检测结果从单纯的数据(或数据曲线)表示到由二维甚至三维图像表示。

四  光学分子成像的特点

　　光学分子成像的突出特点就是非侵入性地对活体内参与生理和病理过程的分子事件进行定性或定量可视化观察，是目前国际上公认的开展活体内分子事件研究的主流手段之一，在生命科学研究中具有重大应用前景。
　　作为分子影像学的重要成像手段之一，光学分子成像的技术相对稳定(如应用GFP基因是分子生物学已成熟的技术)。可应用不同影像探针发出不同波长的荧光来研究不同基因的同时表达，相对于MR分子成像、核素分子成像，光学分子成像要求的设备造价不高，因而有较广的应用前景，也是目前分子影像学研究的热点。
　　在发展多功能光学分子探针的同时，光学分子成像技术也正向多元化方向发展：建立和发展时间、空间分辨率更高，测量范围更大(从微米到几厘米)，检测深度更深(实现小鼠的整体成像)的在体光学层析分子成像技术。充分发掘和利用光学信息(强度、光谱、寿命、偏振)，直接记录和显示分子事件及其动力学过程，将是光学成像技术的主要发展方向。
　　光学分子成像因其操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，在刚刚发展起来的几年时间里，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。

（全文完）

来源：《世界医疗器械》
 
 

光学分子影像学 第三讲 GFP光学分子成像

申宝忠先生，教授，博士生导师，哈尔滨医科大学附属第四医院院长兼影像中心主任，全国高等医学影像教育研究会副理事长，中华医学会放射学会委员、磁共振学组副组长，美国分子影像学会会员，黑龙江省放射学会主任委员。

关键词：GFP成像原理

一  GFP光学分子成像原理

　　1994年，Chalfic等从研究维多利亚水母(Aequorea Victoria)发光现象中分离纯化出绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因，由于其荧光稳定、检测方便、对活细胞无伤害等优点，已被作为一种标记基因(Marker Gene)广泛应用到生物学的各个领域。目前，转染绿色荧光蛋白的肿瘤细胞可直接用于显示肿瘤的侵袭转移，尤其是显示微小侵袭灶及单个细胞的侵袭，为揭示肿瘤细胞的侵袭转移规律提供了简便、直观、有效的工具。

1. 绿色荧光蛋白的结构

　　在荧光蛋白中GFP是非常独特的一个，它是一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为270000。GFP的一级序列已由cDNA序列推导出来，1974年得到GFP的结晶；1988年报道了其衍射图谱；1996年解出了GFP的立体结构，即由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围11条β桶状结构(β-barrel)组成的二聚体。β-折叠形成桶状结构的外围，桶状结构和位于其末端的短α-螺旋以及环状结构一起组成一个致密的结构域，发色团位于螺旋中部。
　　a. 发色团的结构
　　发色团本身是个对羟基—苯亚甲基—咪唑啉酮(图1)，由65~67位的氨基酸残基(丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸，Ser-Tyr-Gly)通过自身环化和氧化形成为一个稳定的环状三肽结构。环化残基主链组成了咪唑啉酮环，多肽的主链在图中显示为红色。尽管在其它蛋白质中也可发现相同的氨基酸序列，但其并非蛋白质的环化，也非酪氨酸氧化，更非生色基团。这就暗示组成生色基团的趋势并非三肽的内部特性。
　　b. 发色团的生物合成
　　图2是发色团的生物合成图。其中R1代表残基1-64，R2代表残基68- 238，其主要步骤为：第一步，Gly67氨基亲质子性地结合到Ser65的羰基上(左上)，然后脱掉水分子形成咪唑啉酮环(右上)；第二步，Tyr66的α碳-β碳键氧化放出一个大基团(下方)。该合成图是基于以下观测：重组GFP(如在E.coli)表达不需要来自A. victoria的特殊酶来形成荧光团。如果可溶性GFP在大肠杆菌厌氧条件下表达，它就不发荧光，否则它就不能和变性SDS凝胶上的天然GFP区别开来。进入空气后，即使在非常稀释的裂解液中厌氧表达的GFP也会逐渐产生荧光。
　　c. GFP的三维结构
　　(1)β-罩结构：Yang等人描述了重组野生型A. victoria GFP的晶体结构(图3)，精度达到0.19 nm。Orm?等人研究A. victoria GFP S65T变种的晶体结构精度也达到0.19 nm。
　　GFP是一种典型的新型蛋白折叠，Tang等人称之为β-罩结构。从外表看11条反向平行的β丝状体(绿色)组成一个非常紧凑的圆柱体。β结构内部是一个α-螺旋(深蓝色)，GFP螺旋中心是发色团(红色)，罩的边缘还有一些短的螺旋片段(淡蓝色)。该圆柱体直径3 nm，高度4 nm。发色团位于分子中心的紧凑单结构域可以解释许多GFP的特性，例如：GFP性质稳定，只有在6M盐酸胍盐90℃下或4<pH<12才会变性；去掉一个N-末端或从C-末端上去掉7个以上的氨基酸会彻底丧失荧光，该蛋白质也没有了完整荧光团的特征吸收光谱，即使“β”的一点点缺失都不能形成β-罩结构；GFP可以被融合到另一个蛋白质的C-末端或N-末端等。
　　(2)拓扑折叠：图4显示了折叠的拓扑图，红色的α-螺旋从后面与绿色的β条带结成环，同时显示了二级结构始端和末端的残基数量。
　　Orm?等人也发现了S65T变种的相同拓扑结构，在N-末端有一个附加的短α-螺旋，在第6和第7β条带之间是一个环而不是α-螺旋，他们认为二级结构并没有精确的始端和末端。这些不同观点可能使用了不同的算法检测二级结构。
　　(3)Cysteins半胱氨酸：两个半胱氨酸(黄色)，一个Cys48在β条带 3上，另一个Cys70在内螺旋中，它们没有形成二硫键。Cys48可能会部分溶解，而Cys70被埋在蛋白质的核心(图5)。
　　(4)色氨酸荧光：GFP有一个单体色氨酸Trp 57(蓝色)，离发色团(红色)有1.3~1.5 nm的距离，二者之间被苯丙氨酸Phe 64和Phe 46隔开。环型系统的长轴几乎与发色团的长轴平行(图6)，因此从色氨酸到发色团可以发生有效的能量转移，这就解释了为什么看不到色氨酸发射荧光。
　　(5)发色团的环境：发色团几乎在圆柱体的中心得到保护，不能被大量溶解，酶也不太可能进入催化它的形成，这就更加强调了自动催化发色团形成的假说。发色团平面与圆柱体大致对称垂直。Orm?等人在发色团的一边发现了一个大腔，但不对大量溶剂开放，可能充满了水。
　　d. GFP的衍生物
　　近年来，用聚合酶链反应(Poly-merase Chain Reaction，PCR)和羟胺突变等方法产生GFP突变型，在一定的波长下发出黄色光。如生色团中酚盐阴离子后加一个芳香环的变种GFP，虽然529 nm处荧光呈绿色，但在拖尾峰更长的波长处却产生黄色荧光，因此被命名为黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein，YFP)；而在Y66HGFP变种的生色团中加入一个咪胍基可发射蓝色荧光，称其为蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescent Protein，BFP)；双突变体Y66H/Y145F能在381 nm光的激发下产生455 nm的蓝光，故称之为BFP。此外，这种蓝光还能进一步激发GFP产生绿色荧光，这种现象称之为荧光共振能量转移(Fluo-rescence Resonant Energy Transfering，FRET)。利用FRET不仅可以研究蛋白之间及细胞器之间的相互作用，还可以检测到蛋白亚基间的相互接近。红移型绿色荧光蛋白(Red-Shifted Green-Fluorescent Protein，RSGFP)由组成GFP氨基酸序列中第64~69残基依次突变而形成，其一个突变体RSGFP4也具有单一激发光谱(490 nm)，但其荧光强度较野生型绿色荧光蛋白(Wild-Type Green-Fluorescent Protein，WTGFP)高4倍。在RSGFP4基础上进一步改造，可得新型突变体——红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)。利用HFP和RFP标记不同的蛋白质就很容易在荧光显微镜下将它们区别开来，也可用此特点对细胞内不同细胞器进行标记来研究其相互作用。此外RFP和BFP之间亦可发生FRET现象，因此，为不同蛋白之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。

2. GFP的发光原理

　　a. 生物体内GFP的发光原理
　　一些能发出荧光的腔肠动物，如维多利亚水母或Renilla Reniformis海参都能发出绿色荧光。刺激A.victoria水母可以发出绿光，然而当从A.victoria水母发光细胞中提纯钙触发光蛋白——水母蛋白时，发出的是蓝光而不是绿光。1994年，Chalfic等从研究维多利亚水母发光现象中分离纯化出GFP。研究发现，GFP是作为能量转移的接受者，分别接受了来自于水母A.victoria和海参R.reniformis体内的Ca²⁺激活的光蛋白能量，发出可见绿光。水母发光蛋白是一个21.4 kD的脱辅基蛋白质、分子氧和咪唑化合物的复合体。当水母发光蛋白被Ca²⁺激发，它就会催化咪唑化合物氧化，即变成了激发态，回到基态(浅褐色)时，纯化的水母发光蛋白发出470 nm的蓝光。活体下能量由咪唑化合物转移到GFP，GFP作为次级荧光蛋白吸收了来自受激水母蛋白的能量，发出可见绿光。
　　A.victoria水母的生物发光机制(见图7)。
　　b. GFP报告基因成像中GFP的发光原理
　　GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65~67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化，形成发色团，因而它无需再加任何酶和底物，在紫外线或蓝光激发下就能发出荧光，且不像其它荧光素那样荧光容易淬灭。在450~490 nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10 min以上。GFP受激发后，其发光团内部发生的F?rster循环是发光的基础。
　　c.F?rster循环
　　GFP是第一个已知的蛋白质核心内F?rster循环的例子(图8)。
　　根据Tyr66在氢氧根形式(图8左上)或酚盐形式(图8左下)，荧光团的吸收峰分别在395 nm或470 nm，而且酚类在激发态时比在基态时酸性更强，假设激发态荧光团(图8右上)变成激发态酚盐(图8右下)唯一的荧光物就会发出509 nm的绿光。结果一个循环形成：荧光团吸收一个光子，丢失一个质子，再发出一个光子，最后接纳一个质子回到初始状态。
　　d. GFP激发和荧光发射光谱
　　变性GFP 不发荧光，其吸收光谱与天然GFP也明显不同。这一点提示，发色团与其周围环境间的非共价键交互作用对光谱特性影响很大，荧光由氨基酸介导，对GFP三级结构中的发色团关闭。
　　来自A.victoria的天然GFP(蓝色)激发光谱有两个激发峰，395 nm和470 nm。荧光发射光谱在509 nm处有一峰值，540 nm处有一肩峰。产生于大肠杆菌的重组A.victoria-GFP与天然GFP有相同的光谱特性；而R.reniformis-GFP的激发光谱却不同，但吸收光谱一致。细胞外pH值升到10，A.victoria-GFP的吸收峰不会受明显影响，恰在变形临界值下(图9)。

3. 荧光探针GFP的特性

　　GFP及其突变体具有独特而鲜明的特点：
　　(1)荧光产生无需借助任何反应底物，且性质稳定、荧光保持时间较长；
　　(2)GFP分子量小，蛋白性质极为稳定，转染细胞后，对细胞无毒性作用；
　　(3)易于耐受高温等处理，无光漂白作用，用甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光特性；
　　(4)能够在异源细胞中稳定表达，无需辅助因子或共反应因子加入即可在紫外光或蓝光激发下发射荧光，而以往的荧光探针多使用荧光素酶(Luciferase)，荧光检测需加辅助因子，且操作繁琐，价格昂贵；
　　(5)便于进行活细胞的实时观察，利用GFP发荧光的特性检测极为方便，普通荧光显微镜即可检测，应用激光共聚焦显微镜效果更佳，还可用流式细胞仪对GFP阳性细胞进行筛选，以获得高表达目的基因的细胞株，而对细胞无伤害作用。
　　GFP在哺乳动物细胞系，尤其在肿瘤细胞中高表达，为示踪肿瘤细胞定位、归宿提供了直观而有效的工具。
　　例如，传统的病毒感染检测及定位研究主要采用组织印渍法、放射性核酸探针法或将报告基因引入病毒基因组作为标记等，但这些方法均必须在分析前对组织进行固定等处理，因而阻止了感染过程的继续。新型报告分子GFP克服了上述缺点，可用其对生活状态下的细胞进行实时、非破坏性的跟踪，观察病原微生物对宿主的感染轨迹，从而研究病原微生物与宿主细胞之间相互作用关系。Cesper将GFP基因插入烟草花叶病毒(TobaMo Virus，TMV)的基因组中，用该病毒感染的烟草叶片在紫外光下可观察到绿色荧光区域。

4. GFP报告基因的特性

　　作为光学分子成像最常用的报告基因——绿色荧光蛋白基因，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白基因。水母的GFP基因是目前惟一已被克隆的GFP基因，其表达产物GFP荧光很稳定。GFP基因序列短，分子量小，不影响目的基因的表达及目的蛋白的结构和功能，GFP的存在不影响融合蛋白的活性，对抗原或抗体的标记效率为100 %。当受到紫外线或蓝光激发时，可自发地发射内部绿色荧光，易于观察，因此GFP基因适合作为报告基因来研究基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等，尤其应用在肿瘤研究方面，它有如下优点：
　　(1)GFP荧光特性相对稳定：只有在过热(＞65℃)、过酸(pH＜4)、过碱(pH＞13)或其它变性剂(如胍基盐酸)存在的条件下，GFP才会变性，荧光消失。一旦恢复中性pH环境，或是除去变性剂，荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱。而且在很大pH范围内(7~12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。即使在用甲醛或戊二醛固定的细胞中，GFP的荧光也不受影响，适于与其它荧光试剂同时进行双标实验。
　　(2)GFP检测方便：用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察。
　　(3)GFP基因无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制：Chalfie等用PCR方法扩增GFPcDNA后，克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌，经活性诱导物诱导后，在紫外光照射下转化细菌发出绿色荧光。
　　(4)GFP对受体细胞基本无毒害：Sheen证实在玉米转GFP基因植株中，即使GFP在细胞中的表达量很高时，对细胞也不会产生明显毒害。
　　(5)不受假阳性干扰：由于其它生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。
　　(6)GFP是一种稳定的、可溶性蛋白，对光稳定，发色团是其蛋白质一级序列所固有的。

二  GFP在分子成像中的应用概况

　　源于水母等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白是一种极具潜力的标记物，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且荧光性质稳定。与现有的标记物相比，GFP具有无可比拟的优势，因而自GFP被发现以来，一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理想标记物，广泛应用于转基因动物的研究、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化、病原菌侵入活细胞的分子过程研究等。这表明GFP是一类能在现代细胞生物学和分子生物学研究与临床检测中发挥重要作用的较理想的基因表达标记物。

1. GFP在研究肿瘤生长、侵袭和转移中的应用

　　肿瘤转移除表现在一般细胞增殖外，还包括瘤细胞的脱落、血液中循环、侵入淋巴管、细胞着床等一系列复杂的过程。目前，对肿瘤的侵袭和转移机制，尤其是早期肿瘤形成过程缺乏足够的认识。肿瘤侵袭在体实验，要求具有灵敏性高、稳定性好、可靠性强的报告基因，对瘤细胞进行标记，以便能在正常细胞中识别少量甚至单个瘤细胞。以往用β-半乳糖苷酶(Lac-Z)转染肿瘤细胞示踪瘤细胞，或者用抗肿瘤细胞特异性抗原抗体进行免疫组化分析，操作复杂程序繁琐。  
　　Chrishi等将HGFP-S56T转染CHO-KI瘤细胞，经过腹腔接种、静脉注射建立的人工转移模型，可示踪瘤细胞的浸润、运行及组织内定位的全过程，且荧光基因稳定表达，实验结果表明，GFP可作为肿瘤侵袭性研究的良好示踪标记基因。

图1


图2


图3


图4


图5


图6


图7


图8


图9

2. GFP在研究肿瘤血管生成中的应用

　　光学分子成像也被应用于肿瘤血管生成方面的研究。Hoffman等应用GFP标记肿瘤细胞建立的多种理想的活细胞标记动物模型，来反映体内肿瘤生长时微血管形成的实际过程。

3. GFP在基因治疗中的应用

　　在基因治疗中，常需要挑选高表达目的基因的克隆，以往通常使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western-Blot等方法来检测目的基因的表达水平，挑选高表达目的基因的克隆。
　　将GFP或其突变体基因与目的基因融合后转入细胞中，当其表达时即可通过流式细胞仪在生理状态下筛选或分选出荧光细胞，从而获得表达目的基因的靶细胞，该细胞可以用于细胞移植介导的基因治疗，亦可用于进一步培养和研究。目前已有用流式细胞仪快速、高效分析并分选表达GFP的造血干细胞的报道。GFP在研究肿瘤的基因治疗及定位定量显示肿瘤细胞目的基因的表达中有广泛的用途，其中自杀基因治疗近年来在肿瘤细胞治疗策略中备受青睐。其原理是用GFP基因与目的基因转染肿瘤细胞，使无毒性前体药物转变为毒性产物而杀死肿瘤细胞，利用GFP的荧光特性，可定量检测和分析载体的转染表达效率。

三  GFP光学分子成像的优缺点

　　以GFP为代表的荧光成像，操作相对简便，无需底物，且产生的荧光表达时间长，但其波长有限，无法穿透深部组织。除此之外，GFP没用信号放大作用，它不能像酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大，这是其应用受到限制的主要原因。另外，有报道在实验中出现GFP诱导的免疫源性反应。

四  GFP光学分子成像的研究现状与展望

　　目前对GFP的荧光机制及应用已有了许多了解，但对GFP的研究领域仍面临许多空白和挑战。例如：GFP是如何折叠成桶状结构的？突变是如何影响发色团的？如何提高GFP荧光检测的敏感性？如何区分GFP转染的肿瘤细胞和含有GFP的吞噬细胞？相信随着对GFP的生物化学特性、发光机制及生物安全性等研究的不断深入，理化特性更稳定、荧光更强、更持久以及更安全的新型突变体将不断涌现出来，这必将为GFP的应用开辟更广阔的前景。
　　未来在细胞生物学领域，GFP的研究有望在以下几个方面取得新突破：
　　(1)细胞工程方面：以GFP为标记，经过活体转染、离体分离分选(In vivo Transgene and In vitro Separating and sorting Cells，ITISC)法快速、高效地获得基因修饰的原代靶细胞。
　　(2)环境保护方面：如污水处理中“绿色菌”的应用。
　　(3)肿瘤学方面：用于癌细胞的生长、复制、浸润、转移等研究。

光学分子影像学 第四讲 近红外线荧光成像 (上)

 

申宝忠先生，教授，博士生导师，哈尔滨医科大学附属第四医院院长兼影像中心主任，全国高等医学影像教育研究会副理事长，中华医学会放射学会委员、磁共振学组副组长，美国分子影像学会会员，黑龙江省放射学会主任委员。

关键词：近红外线荧光成像

一  概述

　　1800年英国物理学家赫胥尔从热的观点来研究各单色光时发现了红外线，并且把光谱中看得见的那部分波称为可见光，而人眼看不到的波称为线。分子影像学中近红外线荧光成像的近红外线波长范围是600~900 nm，而通常情况下的近红外线成像设备可以感应的红外线波长范围为770~1000 nm。分子影像学研究中应用的红外线成像设备的特殊之处就是能探测物体表面的红外线辐射场，即温度场，帮助我们看到肉眼观察不到的事物。1961年Williams用红外线成像仪拍摄了世界上第一张乳腺癌热图，20世纪70年代中期红外线治疗仪开始兴起，1975~1976年传入我国，并得到迅速发展。医用红外线技术涉及的领域包括红外诊断技术和红外治疗技术。红外诊断技术的应用有红外热成像仪、红外光谱组织血氧检测仪、红外线吸收谱仪等；红外治疗技术，包括远红外治疗仪、近红外治疗仪等。
　　分子影像学中应用的近红外线荧光成像技术和传统的红外线技术是截然不同的两个概念。近红外线荧光成像是由低能量的激光作为光源，发射出近红外区非电离辐射，近红外线和组织发生交互作用，发射出可由高灵敏度CCD相机俘获的信号。
　　1994年，Folli等对抗体进行荧光标记，探测人类鳞状细胞癌细胞，开始了近红外线活体荧光成像，尽管取得了一定成绩，但这些研究成果并没有引起人们太多的注意。荧光素—抗体探针分子量大，机体免疫反应强烈，进入肿瘤的弥散速率低，在体内代谢时间短，因此难以推广。1995年，Ballou等应用荧光素—单克隆抗体探针研究恶性肿瘤的发生机制。Weissleder等研究小组自1999年开始应用荧光素标记一些与受体(生长激素释放抑制素受体、基质金属蛋白酶受体、表皮生长因子受体等)特异性结合的小分子肽类物质(配体)，在过度表达这些受体的鼠类肿瘤模型上进行近红外线活体成像研究。2003年，Weissleder的研究小组又开始了用荧光素—配体探针标记肿瘤细胞膜上高表达的尿激酶受体的研究。近些年来，随着近红外线荧光成像研究的深入开展，不断有新的成像靶点的发现和新型荧光化合物探针的合成。

二  近红外线荧光成像的基本原理

1. 黑体的红外辐射规律

　　所谓黑体，简单地讲就是在任何情况下对一切波长的入射辐射吸收率都等于1(即完全吸收)的物体。作为自然界中实际存在的任何物体对不同波长的入射辐射都有一定的反射(即吸收率不等于1)，所以黑体只是人们抽象出来的一种理想化的物体模型。但黑体热辐射的基本规律是红外线研究及应用的基础，它揭示了黑体发射的红外热辐射与温度及波长变化的定量关系，同样，这也是我们研究红外成像的基本出发点。
　　黑体定律分别由以下三个基本定律构成：
　　(1)辐射的光谱分布规律——普朗克辐射定律；
　　(2)辐射功率随温度的变化规律——斯蒂芬—玻耳兹曼定律；
　　(3)辐射的空间分布规律——朗伯余弦定律。
　　这三个定律共同阐述了凡是温度高于绝对零度的物体都会自发地向外发射红外热辐射，而且黑体单位表面积发射的总辐射功率与开氏温度的四次方成正比，温度只要有较小的变化，就会引起物体的辐射功率发生较大变化。这也正是红外线成像的原理基础，即只要有温度存在，就有红外线成像的可能。理论上，自然界中的一切物体，只要它的温度高于绝对零度(-273.15 ℃)，就存在分子和原子无规则的运动，其表面就会不断地辐射红外线。任何存在温度的物体，除可以发出波长在380~770 nm的可见光外，还可以发射不为人眼所见的波长为770~1350 nm范围的红外线。因此，红外线的最大特点就是普遍存在于自然界中，也就是说，任何“热”物体虽然不发光但都能辐射红外线，因此红外线又称为热辐射线，简称为热辐射。
　　只要是活的生物，小至细菌微生物和各种动植物细胞，大到植物、动物甚至人，都存在自发的光子辐射。通常，这种光子辐射极其微弱，只有几个到几千个光子/秒/平方厘米，故称为系统自发的超微弱发光。其光谱范围颇宽，从紫外延伸至近红外，必须用灵敏的光电探测器才能探测到。近30年的研究表明：生物超微弱发光与生物的氧化代谢、细胞的分裂和死亡、光合作用、癌变以及生长的调控等许多基本的生命过程都有着内在的联系。

2. 红外线的生物效应

　　红外线是一种电磁波，研究红外生物效应的机制也就是要研究电磁波与生物系统的一种特定的相互作用。
　　红外线照射到人体后，产生两大效应——热效应与非热效应。
　　a. 热效应
　　热效应是人体在电磁波作用下体内分子以碰撞或辐射方式传递能量产生的效应，效应的能量是电磁波在人体内部转化的热能(温度升高)，由此引起的效应称为热效应。组织温度每升高1 ℃，组织代谢水平就增高10 %，从而促进局部血液循环，提高细胞和酶的活性，对治疗起很大作用。
　　b. 非热效应
　　又叫生物效应，是直接以机械的或电磁的能量形式产生的效应，而不是以热能形式产生的效应。非热效应的特点是生物体对电磁波的响应为非线性的(即电磁波强度与生物效应的大小间不是呈正比的线性关系)，在生物效应中，外部电磁波的能量仅起到触发信号的作用，而效应的能量来源则是生物系统内部的代谢能。非热效应的产生与电磁波和生物体的相互作用有关，而且小功率的电磁波能引起明显的生物效应。这是因为电磁波可启动细胞的放大机制，并有自由基和信号分子的参与。自由基是含有一个或多个不配对电子的原子或分子，其外轨道上具有不配对电子，自旋方向相同，具有较高化学活性和顺磁性(与磁场相互作用)。自由基产生的反应一旦启动就不断进行，发生雪崩现象。Ca²⁺被称为第二信使，与许多生理功能有关。激素、抗体、神经递质和化学致癌启动子等分子(配体)与细胞膜上的专门受体结合是依赖Ca²⁺的过程，Ca²⁺产生速度快，非线性释放时，反应可被放大好几个数量级。电磁场可影响配体与膜受体结合，使跨膜电子传输率大大增加。

3. 近红外线荧光成像原理

　　近红外线荧光(Near-InfRared Fluorecent，NIRF)成像是以合适的荧光探针作为标记细胞、蛋白质分子或DNA，用特定波长的红光激发荧光染料，使其发出波长长于激发光的近红外荧光，应用近红外荧光成像设备进行检测，就可直接监测生物体内发生的生化过程、生物机体的生理和病理状态。

4. 近红外线成像的影响因素

　　近红外线成像可能会受到很多外部条件的制约和影响，其中最主要的包括：
　　a. 自身性质的影响
　　不同种类的生物因对辐射的吸收或反射性各异，因此它们的近红外线发射性能也不尽相同，对于近红外线的敏感程度也不同。
　　b. 表面状态的影响
　　任何实际物体的表面都不是绝对光滑的，总会表现为不同的表面粗糙度。因此，这种不同的表面形态将对近红外线反射率造成影响，从而影响发射率的数值。
　　c. 温度的影响
　　温度对不同性质的物体影响是不同的，很难做出定量的分析。
　　d. 物体之间辐射传递的影响
　　物体对于给定的入射辐射必然存在着吸收、反射，而当达到热平衡后，其吸收的辐射能必然转化为向外发射的辐射能。

三  活体近红外荧光成像的方法和设备

　　目前应用于近红外线光学成像的设备很多，包括光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography，OCT)、激光斑点成像(Laser Speckle Imaging)、偏振光成像(Polarization Imaging)、反射荧光成像(Flu-orescence Reflectance Imaging，FRI)、弥散光成像(Diffuse Optical Tomography，DOT)、荧光共振成像(Fluorescence Resonance Imaging)、荧光介导的分子断层成像(Fluo-rescence-mediated Molecular Tomography，FMT)。许多新型的显像技术正在探索之中，它们与传统的可见光成像有着显著的差别。
　　现在最为常用的近红外线活体荧光成像方法主要有以下3种。第一种是使用共聚焦显微镜或多光子显微镜对皮肤表面或表皮下0.5 mm以内的荧光信号进行采集。这种显像方法已用于活体生物学的研究，达到了细胞水平或亚细胞水平。第二种是荧光反射成像(FRI)，是对体表较大范围的荧光显像，它的特点是能够进行活体实时显像，操作简单、方便。第三种是荧光介导的分子断层成像(FMT)，这是一种新的显像技术，也是目前最为先进的显像技术。它通过对活体生物深层组织荧光探针分布的重建，进行分子功能的研究。

1. 光学相干层析成像

　　光学相干层析成像(OCT)系统一般是由光学显微镜和低相干干涉仪组成的，其工作原理类似于超声成像，只不过采用的是光波而不是声波，利用低相干干涉原理排除多次散射光的信号，以直进或近似直进光子(Ballistic or Snake Photons)，利用组织回传的反射与逆向散射的信号，产生与解剖结构有关的结构影像。OCT应用红外线成像手段对观测对象进行二维成像，并结合了低相干干涉和共聚焦显微测量的特点，因此能非侵入性地对活体内部的结构与生理功能进行可视化观察。荧光诱导设备应用激光或白炽光作为光源激发组织，由于不同组织荧光特性的不同，肿瘤组织和正常组织的荧光特性也是不同的。光线还可诱发一些其它的反应，如电生理电位的不同等。活体的光学显微镜能够在紫外线的波段观察组织细胞水平上的微血管发生。
　　光学成像中光子的路径是相当随机的，光穿透组织时会发生折射和反射现象。OCT是专注于一小段范围内的反射光作为信号来源的，产生这种短脉冲和记录这种短暂的时间间隔是很困难的，而且，当发光细胞深藏于组织内部时，反射信号和源信号不能区分。OCT成像系统应用了一种可对光源的波长进行滤过的装置(滤波器)，并能发射出两束光线。其中一束光线作用于一定深度的内部反射装置，记录光脉冲从光源到反射装置的过程，是针对组织的点增益；另一束是作用于角落反射装置。在成像过程中，角落反射装置来回移动，使得来源不同的深度信号被采集，角落反射装置收集信号开始之后，采集组织信号的核心装置启动。
　　因为OCT成像时所应用的波长范围很窄，所以该系统的图像空间分辨率可达10 μm，与日常使用的CT和MR成像相比要精密得多。如果采用宽波长的滤波器滤过激光光源，图像的分辨率可提高到2~5 μm。利用降低象素的办法，能够缩短图像的采集时间，加快容积成像。
　　尽管OCT成像深度仅达4 mm，但足以实现对组织表面体细胞的直接观察而无需细胞染色，为组织学和细胞学研究提供了一种新的方法。例如，可对高度怀疑肿瘤区的表面细胞进行非侵袭性的排查。OCT成像可对实验动物进行活体、动态、连续地观察而不需要处死动物，为生物学的研究提供了一个理想的工作平台。OCT成像系统具有高灵敏的分辨率，能提供细致的二维和三维图像信息，是进行小血管和神经组织生理学研究的理想工具，也会为显微外科手术提供快速的反馈信息。展望OCT成像技术的未来，OCT成像系统发展的主要方向将集中在以下几个方面：进一步加快图像的采集速度和提高显像的分辨率；实现OCT系统和其它成像手段的联合，例如OCT多普勒系统的研发。

2. 荧光反射成像

　　FRI技术是通过激发组织表面或接近表面的荧光素(探针)使之产生荧光，在靶定的波长范围内对荧光进行显像。主要用于对组织蛋白酶、金属蛋白酶及其它一些酶类的研究，也有一些科学家应用该技术对受体进行显像。
　　应用于小鼠的近红外FRI显像系统由四部分组成：
　　(1)一个激发光源；
　　(2)一间控制小鼠活动的显像室；
　　(3)一套记录发射光子数目的设备；
　　(4)一台控制显像获得和存储的计算机(图1)。

图1


　　FRI的突出的特点是可以快速地显像和操作简单，可以对荧光信号进行三维重建，而不足之处就是该技术对深度的依赖性较强，根据实验的种类和选择波长的不同，成像深度可达5~8 mm。显像深度受限制的原因并不是因为激发光穿透能力的问题。激发光线完全能够穿透几厘米厚的组织，特别是应用近红外线，可穿透很深的疏松组织。而是反射的光线不能透过组织从体表发射出来，这才是FRI显像受深度限制的主要原因。另外，在近红外和可见光范围内组织散射光的存在也是显像深度受限的原因之一，而且FRI成像获得的图像是多个层面叠加起来的。因此，即使是没有表面荧光物质的干扰，精确测定深层组织内的荧光素的多少和浓度也存在一定困难。

3. 荧光介导的分子断层成像

　　荧光介导的分子断层成像(FMT)是利用衍射断层显像的原理，利用多点发射，搜集穿透组织的射线产生断层图像(透视法)。FMT致力于对分子荧光探针的浓度进行分析、重建的方法来进行容积成像和三维成像，以达到对分子功能进行显像的目的。FMT是一种新型的成像技术，它基于对具有靶向特异性分子荧光探针成像，通过捕获荧光探针的发射光进行容积重建。该成像技术类似于CT、X射线成像的原则，但是FMT的理论基础是光子和组织的相互作用。目前，FMT成像系统对小动物成像的空间分辨率达到1~2 mm，成像深度为几个厘米。
　　还有科学家应用模拟或虚拟荧光显像的方法进行扫描检查。可想而知，应用荧光分子探针进行断层扫描将为组织功能显像和基因表达的显像提供强有力的证据支持。研究证实，通过利用FMT断层显像系统检测三靛氰染料在肿瘤组织的聚集，来开展对人体乳腺癌相关课题的研究是可行的。目前，多采用不同波长的激发光和发射光进行断层显像，相应的活体荧光显像对比剂和荧光分子探针的种类也很多。
　　医学影像技术在过去的20多年已取得了巨大的进步，然而直到分子影像学的出现使活体动物体内成像成为可能，才实现了对肿瘤或其它疾病的最早期信息的活体、直观监测。例如对肿瘤的生长、侵袭、转移过程的活体、动态观察；对肿瘤及部分神经系统的病变、心血管疾病、免疫系统疾病进行早期诊断并评价疗效；同时还加速了相关药物的研发过程，提高病人的临床治愈率，降低死亡率。FMT成像作为光学分子成像中最重要的检查方法，在上述研究中具有很大应用潜力和发展空间。
　　FMT分子成像需具备以下几个条件：
　　(1)能结合多种基因序列的靶向性强的荧光分子探针；
　　(2)小型化成像分辨率高的显像设备；
　　(3)建立稳定的、精确的活体显像动物模型。活体FMT成像是一种更为精确的计算方法，引入活性荧光探针的方法降低了非特异性背景荧光的干扰，所以不要求背景校正，而且可直接从实验动物的组织中测定参数。
　　FMT与FRI相比有很大的优势：
　　(1)成像的组织更深。FMT可对组织内几厘米深度的感兴趣区进行成像，因此，研究已经不再局限于组织表面。最近的研究发现，NIRF信号可以穿透15 cm的乳腺组织或肺组织，而在成人脑组织中的传播也可以超过5 cm，可对较大的器官进行成像。
　　(2)FMT可对近红外荧光探针进行定量研究。
　　(3)应用荧光猝灭的近红外荧光探针有高度的分子特异性和非常高的信号产出率。
　　(4)应用多功能的近红外线荧光探针可对不同的分子事件中的靶点同时成像。另外，FMT成像提供了一种非常敏感的光子检查技术，相对于PET、MR成像来说，造价低，体积小，安全无电离辐射，显像质量更好，图像分辨率明显高于PET成像。
　　有理由相信，FMT成像是可以在人体显像中实现的。研究证实，应用近红外的吸收/发射光子模式在人类的活体组织中进行的研究发现，分散光束对深层组织的定位和质检功能良好。应用分光断层显像可对人类乳腺组织进行显像，由于该显像是基于对乳腺血管内的外源性发光物质(荧光探针)和内源性发光物质(人类乳腺组织血管中有高浓度的血红蛋白)的探测基础之上的，所以分光断层显像对乳腺的深层组织显像效果很好。此外，也有FMT用于脑的血流动力学研究的报道。最近，Weissleder等人在乳腺和肺组织荧光成像的研究中，应用近红外荧光染料标记肿瘤组织相似物，其显像范围的直径超过15 cm，在脑和肌肉组织的研究中，显像范围的直径超过6 cm。以上研究结果证实：FMT不仅可以用于活体动物的研究，对人类疾病的活体研究也是可行的。
　　另外，一些机构正在研究以激光或滤波光源的形式，利用可见光或紫外线作为光源激发组织，诱导荧光，照亮感兴趣区的组织表面。美国食品及药品监督管理局(FDA)新近资助了一项新型荧光成像系统的开发，即荧光支气管镜(Lung Imaging Fluorescence Endoscope ， LIFE)，这是一种经过改进的支气管镜。激光发射器射出一束蓝光(442 nm)照亮支气管壁的组织，肿瘤区呈现红棕色，而正常组织呈现绿色。与可见光支气管镜相比，LIFE增强了支气管镜检查的敏感性和特异性，更容易发现微小的肿瘤病灶，并可以发现传统的支气管镜误认为是正常组织的潜伏期肿瘤。