[转帖]临床化学方法学验证初步

广东省临床检验中心 卓绮玲

随着社会经济的发展，医院临床实验室的检验技术也日新月异。几乎每月都会有大批代表国外先进技术的进口仪器、进口试剂蜂拥而至。旧的测定系统、测定方法可能要被新的测定系统、测定方法取而代之。对此，我们该如何应对？具体来说，需要时，我们应如何选择、评价和验证一个新的测定系统、测定方法？这是本课要介绍的具体内容。

在美国，有关条例要求实验室在使用任何新的测定方法报告病人结果之前均需对方法进行验证，验证包括方法的精确性、准确性、灵敏度、特异性、线性范围和参考值等。在我国虽然仍未看到相应的条例，但是，为了实验室工作的持续、顺利进行，当我们购进一台新仪器、使用一种新试剂、新方法时，验证仍然是必须的。

怎样的仪器适用于我实验室？

其实，这是一个不可一概而论的问题。在选购一台新仪器、或采用一种新的测定方法时，通常有三方面的问题要考虑：

• 应用特征 这是决定某一仪器或方法能否在某一实验室里顺利执行所要考虑的因素，其中包括：每一试验耗费的成本、每天标本量、所要分析的标本类型、标本体积、整个分析流程所需的时间、仪器成本、人员素质以及安全性能……等等。
• 方法学特征 主要包括方法的灵敏性、特异性。
• 实验特征 包括方法的分析范围、不精确性、不准确性、回收率、干扰以及检出限。

这里，我们主要介绍如何考察实验特征方面的问题。

在我们安装一台新仪器时，厂家通常向我们提供了有关方法学评价或验证的数据，但是，这些数据仍然有赖于我们去检验是否足够、是否可信。

下面是我们借用有关葡萄糖测定的一个例子：

测定项目	浓度水平	CV	斜率(b)	截距（a）	相关系数（r）
葡萄糖	1：12.11 2：4.53	0.79 0.93	1.0377	0.30	100%

这是某厂家在仪器说明书上给出的有关葡萄糖测定的数据。但是，这些数据传递了一个甚麽样的信息？该测定方法是否可以接受？我们似乎一下子很难作出判断。

有关方法验证的数据处理

其实，我们要确切知道某一测定方法是否可以被接受，有两方面的数据必须搞清楚：

1. 该试验的质量标准是甚麽？即对该试验我们所能容许的总实验误差（TE_允许）是多少？

2. 该试验的质量怎样？即有关试验数据所显示实际上总的实验误差（TE_实测）是多少？

要使方法被接受，两者比较，应有：

TE_实测 ＜ TE_允许

即测定方法执行时实际的总误差应小于测定方法允许的总误差。TE 允许通常可以在有关文献查找，如目前我们在PT 活动中使用的 “ CLIA Requirements for Analytical Quality” ，其中对各个专业的多个测定提出了质量要求。一般以三种形式表达：

1. 以浓度的绝对值表示，如 Ca 的测定：靶值±1.0mg/dL；

2. 以百分数表示，如白蛋白、总蛋白：靶值± 10%；

3. 以参评实验室测定值的波动范围表示，如血气pO2：靶值±3SD

TE_实测分为两部分：一为随机误差；一为系统误差。对随机误差的估计通常使用重复试验，然后统计出SD或CV；对系统误差的估计通常使用方法比较试验，并从试验方法和比较方法两者的均值中计算出偏差，或通过回归分析计算出在某一医学决定水平上两种测定方法的差异。对于TE_实测的估计，文献上提供了三种方法：

1. 偏差+ 2 SD， 即有 偏差+2SD ﹤TE_允许；

2. 偏差+ 3 SD, 即有 偏差+3SD ﹤TE_允许；

3. 偏差+ 4 SD, 即有 偏差+4SD ﹤TE_允许。

由此可见，要判断某一测定系统、某一测定方法是否可被接受，关键是要看在医学决定水平上是否有

偏差+ n SD ﹤ TE_允许

我们再看上述例子，在所分析的两个浓度水平上，计算得到的偏差是多少。根据回归直线方程：Y= a + b X

Y：试验方法的测定浓度

X：比较方法的测定浓度

a：直线的截距

b：直线的斜率

当比较方法X 的浓度水平为12.11时，试验方法Y的浓度为

Y = 0.3 + 1.0377 * 12.11

= 12.87

百份偏差为

（Y – X ）/ X*100%

=( 12.87 – 12.11 ) / 12.11 *100%

= 6.3%

又，当比较方法X 的浓度水平为4.53 时，试验方法Y 的浓度为

Y = 0.3 + 1.0377 * 4.53

= 5.0

百份偏差为

（5.0 –4.53 ）/ 4.53 * 100%

= 10.4 %

从PT 方案可知，葡萄糖测定允许的总误差为10%。把上述数据整理成下表：

测定项目	浓度水平	TE允许	CV	偏差%	斜率b	截距a	相关系数r
葡萄糖	12.11 4.53	10 10	0.79 0.93	6.3 10.4	1.0377	0.3	100%

采用“TE 实测= 偏差+ 3SD ”对实际测定时的总误差进行估计，当浓度为12.11时，

TE_实测= 偏差% + 3* CV

= 6.3 + 3 * 0.79

= 8.67（%）

当浓度为4.53 时，

TE_实测 = 10.4 + 3 * 0.93

= 13.19（%）

（注意，这里使用了CV和百份偏差计算实际测定的总误差，其结果是一样的）数据整理如下表：

测定项目	浓度水平	TE允许	TE实测	CV	偏差%	斜率b	截距a	相关系数r
葡萄糖	12.11 4.53	10 10	8.67 13.19	0.79 0.93	6.3 10.4	1.0377	0.3	100%

统计结果表明，该方法在两个浓度水平上测到的实际总误差是不一样的。在较高的浓度水平，TE_实测﹤TE_允许，该测定可被接受；在较低的浓度水平，TE_实测≮TE_允许，该测定不可被接受。

一种方法验证，得到两种截然不同的结论，这似乎自相矛盾，但是，我们要知道，这是在两个浓度水平上的测定结果，出现这样的情况是完全有可能的。至于最终是否把这一测定系统引进我们实验室，这完全取决于实验室的决策人。

此外，我们还可以把同样的数据分析应用到医学决定水平上。如6.11为葡萄糖测定的某一医学决定水平，取X为6.11，计算出相应的Y值和百份偏差，由此得到的TE实测再与TE允许进行比较。CV 可采取与之浓度水平较接近的（即浓度为4.53时）的CV值。

再来讨论一下相关系数r，这是方法比较实验中通常用到的一个统计数字。r等于1.000表示两种方法结果完全相关。以上葡萄糖对照试验r为100%，即1.000，表示完全相关。那麽，怎样看待r以及由斜率b和截距a计算得到的偏差之间的关系？

上图是我们借用葡萄糖测定方法比较的一个直线图。由图可见，虽然两种方法之间存在15 mg/dL 的常量误差，相关系数r仍然表明为0.999。其实，在回归直线分析中，r 只是提示由两种方法测定结果得到的数据点与直线的靠近程度，1.000或100%并非表明两种方法的测定结果完全一致。

此外，在方法比较实验中，相关系数r 还受测定标本浓度范围的影响。浓度范围越大，r → 1.000，浓度范围变小，r 值变小。

归纳与建议

实验室在建立一个新的测定系统或一种新的测定方法时，一定要进行方法学评价或验证，验证过程包括：

• 明确质量要求，确定临床上允许的总误差，即TE允许；
• 通过有关实验，了解各类型误差存在的情况；
• 收集必要的实验数据进行统计，估计误差的大小；
• 把估计的总误差与临床允许的总误差进行比较，判断新的测定系统或方法是否可被接受。