试剂的研制与质控物的制备[转帖]-->yeec转移

第一节 试剂的研制 　血液分析仪的使用试剂一般分为稀释液，溶血剂和清洗剂三种。良好的试剂对保证仪器的正常运行和日常维护及获得准确的测试结果至关重要。因此，原则上应使用原机器的配套试剂，但进口试剂价格昂贵，运输不便，影响日常使用，目前国内许多单位开始研制替代试剂。 　　一 试剂在全血分析中的作用 　　目前，国内使用的血液分析仪基本上是进口产品且绝大部分因电阻不同而采用阻抗法。阻抗法计数细胞的原理是根据细胞在测试过程中产生的脉冲大小与仪器设定的阈值比较而得出的数据。脉冲的大小除与细胞本身的大小（如白细胞中粒细胞体积最大，淋巴细胞最小）有关外，还与溶血剂的种类，浓度，溶血剂的加入量与溶血时间及稀释液的渗透压，离子强度，电导率，仪器出厂时固定的阈电压，孔电流和脉冲的增益等有关。 　　(一)溶血剂： 通常是一类强有力的表面活性剂。不同种类的溶血剂对白细胞形态、大小影响不同，如溴代十六烷基三甲基铵能使白细胞膜皱缩、胞体缩小；而皂素能使白细胞体积增大。反映在细胞计数时的脉冲大小变化时，前者白细胞的脉冲小，后者的白细胞脉冲大,在白细胞直方图上的变化见图9-1￣9-2所示。 　 同一种溶血剂，其浓度高低不同，对白细胞体积影响也不同，通常是随着溶血剂浓度增高，白细胞的体积缩小，测量时的脉冲也变小。 随着溶血剂的用量增加或溶血时间延长，白细胞的体积也逐渐缩小，测量时的脉冲也变小，直方图的变化这是因为在这两种情况下， 白细胞膜破裂，皱缩在细胞核周围的胞浆颗粒及胞膜脱落，而仅剩细胞核。因此，欲获得准确的白细胞计数及分类结果,应使用配套溶血剂或与其性能相同的自制溶血剂。 　　(二)稀释液： 通常是一类具有酸碱缓冲作用、适当的离子强度和电导率的等渗溶液。适当的离子强度和与血浆相同的渗透压,能在一定的时间内完整地保持血细胞原来的体积;而合适的电导率能保证获得与细胞体积相应的脉冲大小。稀释液的配方成份不同，尽管能将其渗透压调整到与配套稀释液一致，但其电导率也不可能相同，测试时获得的细胞脉冲大小也不会相同，见图9-11￣9-12所示； 如果将电导率调整到与配套稀释液一致，其离子强度，渗透压也不可能一致，同样影响测试结果。这些变化不仅影响MCV、RDW、MPV， 还影响WBC计数及分类结果。因此，欲得到准确的测试结果， 应使用配套稀释液或与其性能相同的自制稀释液。 　　(三)使用自制试剂必须具备下列条件： 　　1.自制试剂在成分与剂量上与配套试剂不尽相同, 但同一份血液在配套试剂体系（稀释液＋溶血剂）与自制试剂中细胞产生的脉冲信号是相同的，白细胞分类直方图是重合的，细胞分类结果应一致。如达不到这一点，不能替代进口试剂。 　　2.在红细胞、血小板测试体系中，细胞数、MCV、MPV在两种试剂中所得结果应是相同的（如果仪器的计数阈值是可调的，至少应在允许的变异范围内）。空白计数应符合仪器的标准。 　　3.溶血剂溶解血细胞的程度、速度以及Hb与溶血剂作用后生成的Hb衍生物的吸收光谱与HiCN应相似，吸收峰最好在540nm。 　　4.自制试剂的成分不应损坏机器的部件或影响使用寿命。 　 二 试剂的研制方法 　　1.仔细分析进口试剂中各主要成分及含量，为自行设计配方做准备。如分析稀释液，测试的主要成分包括Na+、K+、 SO42-等。 　　2.测试进口试剂的主要理化指标，如pH、渗透压、电导率、比重、白细胞粒度分布曲线、血红蛋白吸收光谱曲线，为鉴定自制试剂确定标准。 　　3.设计自制试剂配方，并制成使用试剂。 　　4.检测自制试剂的主要理化指标并与进口试剂进行比较。 　　5.如果两者之间有差别，即要修改自制试剂配方直至其理化指标与进口试剂基本一致。 　　6.取EDTA-K2抗凝的新鲜静脉血， 分别用进口试剂和自制试剂在同一仪器上测试,观察两者测试的多项参数及WBC、RBC、PLT的直方图是否一致，有无报警信号。否则，需要继续调整自制试剂的配方，以获得以配套试剂一致的结果，并且不增加报警信号，如图9-15、16所示。只有这样，才能为称为合格的试剂。 　 　三 试剂的主要成分及其作用 　　(一)稀释液（Diluent） 　　　氯化钠：提供并调节稀释液的离子强度，渗透压和电导率。 　　　氯化钾：维持稀释液的pH值并起酸碱缓冲作用。 　　　乙二胺四乙酸盐：抗凝剂。 　　　叠氮钠或醋酸洗必泰（药用）：防腐剂。 　　根据仪器不同，有的配方（如CELL-DYN 1400）中还有1,3-二甲脲， 其作用是维持血样中的血细胞呈悬浮状态，便于仪器准确计数。还有的配方中（如 Sysmex F-800）用硼酸与硼砂作为缓冲对代替磷酸盐缓冲对，其作用就是提高稀释液的pH值。但是，无论稀释液的配方中的成分如何变化，稀释液必须符合下列要求： 　　1.稀释液应清亮透明，不得有沉淀，絮状物。 2.对被检测的细胞无有害影响,能在数小时内完整地保存细胞原来的体积。 3.有适当的电导率，在微孔内外电极间的电阻最好为10~20KΩ。 4.必须是等渗溶液，其渗透压在300~340mOsm/Kg之间；也有少数仪器例外（如Sysmex F-800，其渗透压在250mOsm/Kg左右）。 5.pH值接近中性，具体数值因各厂家的仪器不同略有差异；有少数仪器差别较大，F-800的pH值为7.8，而cc-180的PH值为5.8。 6.空白计数符合仪器要求，通常为： RBC≤0.05×1012/L WBC≤0.3×109/L HGB≤2g/L PLT≤10×109/L 7.对具有白细胞分类计数功能的血液分析仪，在加入溶血剂至白细胞计数完毕这段时间内，其使用的稀释液必须能保持每个白细胞膜的完整，以便得到准确的白细胞分类值，如图9-17所示，否则，WBC直方图拉不开,如图9-18所示。 　　8.对某些仪器（如AC系列的血液分析仪），其使用的稀释液还必须满足HGB 测定的零点参考要求。 　　(二)溶血剂（lyse） 　　1.溴(氯)代十六烷基三甲基铵(CTAB或CTAC)：是一种强有力的表面活性剂，其主要作用是溶解红细胞，释放出血红蛋白；另一方面还作用于白细胞膜，使其胞浆渗出，胞体收缩，便于白细胞计数。 　　2.高铁氰化钾：将血红蛋白氧化成高铁血红蛋白。 　　3.氰化钾：与高铁血红蛋白结合生成氰化高铁血红蛋白(HiCN)，便于血红蛋白定量测定。 　　4.其它：如triton x-100、乙醇、异丙醇，主要作用是防止溶血剂在低温时结晶及提高溶血力效果不错。但无论其中的成分如何变化,溶血剂必须符合下列要求: 　　(1)试剂应清亮透明，不得有沉淀，絮状物。 　　(2)对半自动血液分析仪所用的溶血剂： 　　　①1:500稀释的血样，加入100ul溶血剂混匀后，3分钟内澄清，A750≤0.012　　　②Hb测定值在45分钟内保持稳定。 　　 ③WBC测定值在45分钟内保持稳定。 　　(3)对全自动血液分析仪所用的溶血剂： ①能迅速溶解红细胞膜，释放出血红蛋白，保证溶解的红细胞膜碎片＜2fl。　　　②在特定的时间（因仪器而异，20"，25"不等）内，能迅速将释放出来的血红蛋白转化成稳定的血红蛋白衍生物。 　　　③在特定的时间内（同②所述），与稀释液相互配合保持白细胞完整，将其胞浆内的颗粒及胞膜本身皱缩在细胞核的周围，便于仪器进行白细胞计数及分类。如图9-19所示,否则将影响WBC计数及分类结果，尤其是分类结果变化更大，见图9-20所示。 　 图9-原装稀释液加自制溶血剂（质量合格）的 图9-20. 原装稀释液加自制溶血剂（质量不合格） 的白细胞直方图 白细胞直方图 (三)清洗剂（Cleaning Agent） 　　根据不同厂家的仪器，通常将清洗剂分为两种，即冲洗液（Detergent ）和清洁剂(Cleaner)。前者见于CELL-DYN系列的血液分析仪，后者见于AC系列和SysmexF 系列等血液分析仪。 　　1.冲洗液：主要成分是氯化钠、磷酸盐缓冲对、氯化钾和非离子表面活性剂。选择什么样的表面活性剂，是冲洗液合格的关键之一。一般选用HLB在12￣15范围的非离子表面活性剂。 *HLB：即亲水亲油平衡值。其计算公式如下： 亲水基的重量 HLB=──────────×20 疏水基重+亲水基重 HLB值越大，表面活性剂的水溶性越好。表2.列举了常用的非离子表面活性剂HLB值。 　　　　表2　常用非离子表面活性剂的HLB值 ────────────────────────────── 表面活性剂 商品名称 HLB值 ────────────────────────────── 失水山梨醇三油酸酯 Spsn85 1.8 乙二醇脂肪酸酯 Emcol EO-50 2.7 失水山梨醇倍半油酸酯 Arlacel 83 3.7 失水山梨醇单硬脂酸酯 Span 60 4.7 失水山梨醇单棕榈酸酯 Span 40 6.1 失水山梨醇单月桂酸酯 Span 20 8.6 月桂醇聚氧乙烯醚 Brij 30 9.5 聚氧乙烯(4)失水山梨醇单硬脂酸酯 Tween 61 9.6 聚氧乙烯(5)失水山梨醇单硬脂酸酯 Tween 81 10.0 聚氧乙烯(20)失水山梨醇三硬脂酸酯 Tween 65 10.5 聚氧乙烯(20)失水山梨醇三油酸酯 Tween 85 11.0 脂肪醇聚氧乙烯醚 Ukanil 43 11.8 硬脂醇聚氧乙烯(10)醚 Brij 76 12.4 油醇聚氧乙烯(10)醚 Brij 96 12.4 鲸蜡醇聚氧乙烯(10)醚 Brij 56 12.9 辛基酚聚氧乙烯(9)醚 Nonidet P40 13.1 聚氧乙烯(4)失水山梨醇单月桂酸酯 Tween 21 13.3 辛基酚聚氧乙烯(9-10)醚 Triton X-100 13.5 脂肪醇聚氧乙烯醚 Lubrol WX 14.9 聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯 Tween 60 14.9 聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯 Tween 80 15.0 丙二醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚 Pluronic L64 15.0 油醇聚氧乙烯(20)醚 Brij 98 15.3 聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯 Tween 40 15.6 鲸蜡醇聚氧乙烯(20)醚 Brij 58 15.7 聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯 Tween 20 16.7 月桂醇聚氧乙烯(23)醚 Brij 35 16.9 ────────────────────────────── 　　无论选用何种非离子表面活性剂，冲洗液必须符合下列要求： 　　(1).符合稀释液的<1>￣<6>条的条件。 (2).能提供足够的湿润作用，以便迅速地从整个流量系统中赶走气泡。 　　(3).在标本测定之前，能从每个测量管中完全排空。 　　(4).能在每个测量管内提供合适的弯月面，并保持到测试完成。 　　(5).能以微形气泡的形式冲洗每个测量管、流量系统、小孔管内壁及血红蛋白流动比色池。 　　(6).在血红蛋白测定时，能提供合适的零点参考。 2.清洁剂（cleaner）：主要成分有 　　　(1).氯化钠：助洗剂，具有降低表面张力、油水界面张力及提高增溶能力。 (2).三聚磷酸钠：助洗剂，对污垢中的蛋白质有膨胀、增溶作用，对脂肪起促进乳化作用，对固体污垢起分散作用。 　　　(3).蛋白酶：将蛋白质污垢转化为水溶性氨基酸，从而较容易被冲洗掉。 　　　(4).磷酸盐缓冲液：为蛋白酶提供一个合适的pH环境，并防止酸碱对酶活力的影响。 　　　(5).非离子表面活性剂：本身具有清洗作用。 　　 (6).蓝色染料：其作用就是便于观察清洁剂，但必须保证选用的染料不能使管道内壁染色，否则宁可不用。 　　　(7).保护剂与防腐剂：能在一定时间内保持酶活力不变并防止细菌生长。 　　无论如何选用上述成分，清洁剂必须符合下列要求：即能有效地清除管道内的污物，保持管道系统清洁，不使管道变色且不腐蚀管道。 　　四 常见的试剂配方 　　(一)稀释液： 　　　1. F-800: NaCl 127.7g Na2SO4 0.94g　 硼酸 20.1g 枸橼酸钠 4.41g 硼酸钠 7.56g 加蒸馏水至20L （摘自《临床检验杂志》1991,6:156） 2. CD-1400: NaCl 4.4g Na2SO4 9.5g NaN3 1.0g 1,3-二甲氨基脲 1.0g 加水至1L （摘自《医学检验杂志》1994,9:86） (二)溶血剂： 　　　1. PC-604: CTAB 3.5g 95%乙醇 30ml 冰乙酸 1.5ml 甲醛 3ml 加水至100ml （摘自《医学检验杂志》1994,增刊(2):157） 2. F-800: CTAB 27g KCN 15g 异丙醇 25ml KH2PO4 5g triton x-100 5ml 加蒸馏水至1000ml （摘自《广州医药》1992,23:26） (三)清洗液: 1. CD-1400(冲洗液): CD-1400 稀释液 + triton X-100 2.5ml/L （摘自《医学检验杂志》1994,9:86） 2. CC-130(清洁剂): SDS 0.2g NaCl 7.5g Na2CO3 0.1g triton x-100 5ml 次甲基兰 0.1g 加蒸馏水至1L （摘自《河北医药》1990,12:25） 五 试剂的配制、鉴定及注意事项 　　自制试剂的配方一经确定，接下来就是按配方称药、溶解、过滤和鉴定，只有认真把好每一关，才能生产出合格的试剂。 　　(一)药品的称量 　　称取的药品准确与否，是配制合格试剂的关键之一。这里主要包括选择合适等级的药品，按称取药量的大小选择合适的天平，注意药品有无结晶水，是否吸潮，挥发及对人体有无不良影响等。 　　1.药品等级的选择： 常用的化学药品一般分为优级纯、分析纯、化学纯及实验试剂四个等级。配制血液分析仪使用试剂要求选用分析纯的化学药品，对少数只有化学纯这个等级的药品，注意选用那些信誉好、质量稳定的厂家的产品。实验试剂这个等级的产品绝对不得选用。 2.天平的选择： 一种试剂配方一般要由几种化学药品组成，但每种药品的用量差别很大（如F-800的稀释液中NaCl 127.7g/20L，而Na2SO4 0.94g/20L）， 在具体称药时不可能用同一个天平来称这两种药。这是因为普通天平根据其称量小而有不同的灵敏度（如1g,0.1g,0. 01g），要根据天平灵敏度的大小及欲称药量来选择合适的天平。 3.有些化学药品含有结晶水（如磷酸氢二钠含12个结晶水）， 在称药前一定要换算，以免称量不够或称量过多（如称Na2HPO4 2.51g，则要称Na2HPO4.12H2O 6.32g才合适），关键要看清配方中的药量是否包含了结晶水。 　　4.有些药品极易吸潮（如CTAB），所以在称药时要选择空气较干燥的环境，而且动作要快，取完药后立即盖紧瓶盖，以免吸潮，影响称量的准确性。 　　5.对某些挥发性的药品（主要是液体药品，如无水乙醇），在量取时动作要迅速，量好后立即倒入容器并盖紧盖，以免挥发。 　　6.有些药品对人体眼睛、呼吸道、皮肤有不良影响（如NaN3，1,3-二甲氨基脲的药瓶标签上明确标名了这种危害）。因此，称药时应戴口罩，并避免用手接触药品，如不慎沾到皮肤上,应立即用流水冲洗干净;如渐到眼睛里先立即用流水冲洗，然后请眼科医生处理。称药时操作人员的自我保护意识非常必要。 　　7.不同厂家甚至同一厂家不同批号的药品，其中所含的有形杂质差别很大（如十二烷基硫酸钠），因此，在称取药品时，应根据不同厂家产品的具体情况，对配方中某种药品的称量作适当的调整。否则，如果未注意到这一点，虽然是按配方的标示量称药，有时配制的试剂测试效果并不理想。 　　(二)药品的溶解 　　血液分析仪的应用试剂基本上是水溶液，配制不同的应用试剂，对水质的要求也有所不同。例如配制清洁剂，只需要用普通的蒸馏水就可以了；而配制稀释液，则要求用双蒸馏水或去离子水，而且其电导率应＜1.0×10-4sm-1。如前所述， 目前使用的血液分析仪主要是采用阻抗计数原理，欲获得准确的结果，则需要所用的试剂有合适的电导率等。而试剂的电导率除了与其中溶解的药品的种类、浓度有关外,还与溶解这些药品的水质有很大的关系。这是因为水中溶解有各种正、负离子,这些离子具有导电功能。通常普通水的电导率为1.0×10-1SM-1（25℃）。 只有将水通过多次蒸馏或将水通过装有离子交换树脂的交换器，把水中溶解的各种正、负离子除去，得到蒸馏水或去离子水，使其电导率符合要求。 　　不同种类的药品具有不同的溶解度，因而其在水中的溶解方式也不一样。在室温，对水溶解度大的药品，一般令其自然溶解；对水溶解度较小的药品，一般需加热助溶，但要注意防止溢出。 　　(三)平衡液量 　　溶解好的药品需倒入到一个体积较大的容器内，并用蒸馏水或去离子水加至预定的刻度，然后混匀。这里有两点需要注意。第一，容器的选择，平衡液量所用的容器要有较大的体积，形状稳定不变形，且其构成成分不被水溶解。第二，水温的选择，一般要求水温为25℃。水温过低或过高，均会影响水的加入量，最终影响试剂的理化指标。这是因为水温过高时，水分子运动速度快，分子间的距离大，水的密度就小；此时平衡液量，虽然加入量确定，但等水的温度恢复到25℃时，水分子运动速度减慢，分子间的距离缩小，水的密度增大，水的体积相应缩小，导致水的加入量不足。反之,导致水的加入量过多。因此,保持水温在确定的温度至关重要。 　　(四)过滤与分装 　　虽然我们选用的是分析级的药品，且对水质也有较高的要求，但是，在药品溶解后仍能看到水溶液中有许多有形杂质。如果不除去这些杂质,必将影响测试结果，目前，主要采用过滤的方法除去这些杂质。过滤后的试剂保存于何种容器中才能保持稳定也值得注意。 　　1.滤器的选择：血小板是血液中体积最小的细胞，在计数时易受稀释液中杂质的影响。因此，在过滤试剂时要考虑到这一点。一般的作法是：有血小板计数的血液分析仪的试剂，过滤时选用滤膜孔径较小的滤器（如G6或不锈钢滤器配上孔径＜0.3um的滤膜）效果较好；若无血小板计数的血液分析仪的试剂，在过滤时常用 G5或滤膜孔径0.5um的滤器。 　　2.分装容器的选择：分装好的试剂在使用之前一般要保存一段时间，只有能保持试剂在此期间性能稳定的容器才能入选。由于试剂中的水会溶解玻璃中的可溶性物质，因此通常选用塑料容器来装这种试剂。 (五)试剂的鉴定 　　由于配制每批试剂的条件不完全相同（如选用药品的厂家或批号不同）,因此，每批试剂配制完毕,应按要求进行鉴定。内容主要包括电导率、渗透压、pH、比重、粒细胞分布曲线、Hb吸收光谱曲线，空白计数及与进口试剂或与已鉴定合格的自制试剂的测试结果（包括细胞计数、Hb测量及WBC、RBC、Plt直方图）对照， 只有符合既定的要求才能交付使用。

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