血液分析仪使用的全面质量控制[转帖]

解放军总医院 丛玉隆 近年来,先进的实验仪器象雨后春笋,迅速在同内普及使用, 不但给临床提供了许多重要的诊断指标,提高了精确性和准确性,也提高了效率和效益, 为我国检验医学的发展起了重要的推动作用,但由于大量的仪器迅速的引进,某些单位尚缺乏对仪器使用深刻的理解和深 入的技术培训,影响了仪器的正常使用, 甚至由于实验结果误差贻误临床诊断,笔者认为,目前在国内自动化仪器使用; 迫切需要解决以下三个问题:1.严格仪器操作人员的培训,不断提高技术素质和学术水平. 2.严格的实验 室管理和一整套的质量控制措施. 3.检验医学与临床医学的结合,即实验室要及时、 经常使　临床医生对数据检测的质量　控制和临床意义有充分的了解。 　　这就是血液分析仪使用全面质量控制的重要内容。 　　全面质量控制是指从临床医生申请实验开始至实验室完成检测以及登记和发出报千。全过程一系例保证实验质量的方法和措施。它包括分析前质量控制、分析中质量控制和分析后质量控质。 　　一。分析前质量控　制： （一）操作人员上岗前的培训： 　　　随着高新技术在医学检验中的应用，技术人员培训尤为重要，先进的血液分析仪需要高素质的人员去使用，这些人员：（１）上岗前仔细阅读仪器说明书或接授良好的培训。要对仪器的原理、操作规程、使用注意事项、异常报警的含义、引起实验　误差的因素及维护有充分的了解，掌握用ICSH推荐的标准方法校正仪器的每一个测试参数。（２）注意分析前、分析中、分析后每一岳控步骤，注意病人生理或病理因素给实验造成的误差或服用药物的干拢作用，随时监控仪器的工作状态，注意工作环境的电压变化和磁埸、声波的干拢。根据质控图的变化及时进行仪器的调试。测试后要根据临床诊断、直方图变化、各项参数的关系，确认无误后方能发出报告。（３）必须具有高度的责任心和事业心，因此必须重视抓技术人员医德医风的思想教育和专业知识水平的提高。 （二）仪器安装条件： 　　血液分析仪系精密电了仪器，由于测量电平低，易受各种干拢，为了确保仪器的正常工作，必须将仪器放装在一个远离电磁干拢源、热源的位置，放置仪器的实验台要稳固（最好水泥台）、工作环境要清洁（最好操作间单独隔开）、要在防潮、防止阳光直射、通风好的条件中。室内温度应在１５　　，相对湿度应＜８０％，为了安全和抗干拢，仪器应用电了稳压器并妥善接地。为了避免磁波干拢，不要用磁饱和稳压器。 （三）仪器的鉴定 新仪器安装后,或每次维修后,必须对仪器的技术性能进行测试,评价,这对保证检验质量将起到重要作用。1984年ICSH公布了对电子血球计数仪的评价方案, 规定的指标系统全面,对于了解仪器性能和发现问题均有较大意义. 1.精密度 分批内及批间精密度.选红细胞低值,正常值及高值标本各十份, 按常规方法分别测定红细胞数,每份标本重复测定三次,记录结果.将标本放室温二小时,重复上述测定,所得结果分别进行统计学处理,可得到不同含量的精密度, 现以低值红细胞结果为例(表6-3),介绍统计学处理方法(单位1012/L). 全部总和=82.23+83.37=165.6 均值=165.6÷60=2.76 假设标本数为u,批处理为V,重复次数为n,则平方和(sms of squares 以下称SSQ)为:重复试验SSQ=[∑(各测定值)2]-{∑(小计)2/n]=(3.162+3.202......+2. 852+ 2.742)-[(9.512+10.322......+6.382+8.482)÷×]=0.5411 批间SSQ=[∑纵行之和)2/u*n]-[(全部总和)2/u*v*n]=[(82.232+83.372)/10×3] -(165.62/10×2×3)=457.0776-457.056=0.0216 均方(The mean squares以下称MSQ)为: 重复试验的MSQ=重复试验SSQ/u*v*(n-1)=0.5541/10×2×(3-1)=0.0136 批间MSQ=批间SSQ/(V-1)=0.026/(2-1)=0.0216 变异系数(CV)为: 重复试验MSQ 批内重复试验CV=──────── ×100% 均值 0.0136 =──────×100%=4.2% 2.76 批间MSQ+{[(u*n)-1]×重复试验MSQ} ───────────────── u*n 批间重复试验CV=──────────────────── 均值 0.0216+{[(10×3)-1]×0.0136} ──────────────── 10×3 =──────────────────×100%=4.26% 2.76 应该注意的是,高值,正常值,低值标本必须分开进行测定,避免携带污染, 也可用同样方法测定Hb及白细胞的精密度. 2.携带污染率 为避免测定含量高的标本后再测含量低的标本时所产生的影响. 在携带污染率试验前,先测一定数量标本,使测定数达到稳定,然后取一份高值标本,连续测定三次(i1,i2,i3),随后立即取一份低值标本连续测定三次(j1,j2,j3),携带污染率以下述公式计算: (j1-j3) 携带污染率=──────×100% (i1-j3) 例如三次测得高值红细胞结果为7.23,7.22,7.30(1012/L).低值红细胞结果为0.64,0.570.52(×1012/L), (0.64-0.52) 携带污染率=───────×100%=1.77% (7.30-0.52) 按此法测定红细胞,白细胞,血红蛋白携带污染率各五份. 如一时找不到极高值和极低值的红细胞标本,可以10ml稀释液加30ul正常血液做高值标本;10ml稀释液加4ul正常血液做低值标本,亦可同时测定携带污染率. 3.总重复性 包含重复测定的随机误差与携带污染双重变异因素.测定时随机取标本20份, 按常规方法测定白细胞,并放置二小时及四小时后,再分别测定白细胞. 将三次测定结果以变异分析做统计处理,现以测定的白细胞结果为例(表6-4)计算如下: 表6-4 白细胞测定结果 ─────────────────── 全部总和=31.9+60.3+*** ***+47.5标本号 测定值 小计 +10.4=520.2 1 10.8 10.3 10.8 31.9 均值=520.2÷∧∪⌒.67 2 20.5 20.1 19.8 60.3 设标本数为u,重复次数为n,则重复 3 7.3 7.8 7.2 22.3 试验SSQ=[∑(小计2/n]=7093.08-( * 21258.36/3)=6.96 * 重复试验的CV * * 重复试验的SSQ/[u(n-1)] 18 3.6 3.3 3.9 10.8 =────────────×100% 19 15.7 16.9 14.9 47.4 均值 20 3.8 3.2 3.0 10.4 ──────────────────── 6.96/[20×(3-1) =─────────×100%=4.81% 8.67 4.线性范围 一种测定方法,其测定值与稀释倍数成线性关系的范围越广越理想,至少应包括正常范围及常见到的病理范围. 测定方法如下:取抗凝血一份,3000转/分离心30分钟,将血浆与血球分开, 吸血浆0.3ml加盐水至150ml,此为稀释血浆;吸压积血球0.3ml加盐水至150ml, 此为100%血液(相当于压积血细胞稀释500倍).然后按表6-5进行混合. 表6-5 血球混合方法 ───────────────────────────────── 项目 血液浓度(%) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100%血液ml 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 稀释血浆ml 18 16 14 12 10 8 6 4 2 -- ───────────────────────────────── 稀释混合后各吸出0.1ml加盐水9.9ml,即可进行红细胞计数线性测定,将剩余的血细胞悬液加溶血剂,进行血红蛋白线性测定,每个浓度测定三次. 现将血红蛋白线性测定结果及统计处理介绍如下(表6-6): 表6-6 不同血液浓度Hb测定结果 ────────────────────── 血液浓度(%) Hb测定结果(g/dl) ────────────────────── 10 3.2 3.1 3.3 20 6.2 6.2 6.2 30 9.2 9.3 9.2 40 12.3 12.4 12.2 50 15.6 15.2 15.4 60 18.2 18.3 18.2 70 21.1 21.3 21.3 80 23.9 23.8 23.7 90 26.5 26.4 26.4 100 29.0 29.1 28.9 ────────────────────── 设血液浓度为自变量(X),为了简化将10%,20%......100%分别以1,2,.....10 代表,血红蛋白测定值为因变量(Y),总的测定数N,则: N=30,∑X=165, ∑X2=1155,∑Y=495.2 　　　　∑Y2=10239.42 ∑XY=3438.1 直线函数Y=a+bx可诱导如下: 一项=∑XY-(∑X∑Y/N)=714.5 二项=∑X2-(∑X∑X/N)=247.5 三项=∑Y2-(∑Y∑Y/N)=2065.3 b=一项/二项=714.5/247.5=2.88 a=(∑Y/N)-(b∑X/N)=(495.2/30)-(2.88×161.5/30)=0.666 为了评价在某一浓度是否为线性关系,需将从回归线上的偏离变异值与重复试验变异值进行比较.重复试验变异值的求法只是把每个稀释度当做一个标本处理. 重复试验:SSQ=[∑(各个测定值)2]-[(小计)/n]=0.20667 自由度(DF)=u(n-1)=10×(3-1)=20 变异值=SSQ/DF=0.0103 此处u为不同稀释度标本的数目,n为重复测定的次数. 然后计算每个稀释度(此处为100%浓度)从回归线偏离的: SSQ=三项-重复试验的SSQ-(一项)2/二项 =2056.3-0.2066-(714.52/247.5)=2.4256 DF=u-2=8 变异值=SSQ/DF=2.4256/8=0.303 变异比值=F=0.303/0.0103=29.4 其自由度为8及20 查F值表n1=8,n2=20,p0.01处,F值为36.3此例中F=29.4>3.63故P<0.01, 由此可以判定此点己超出线性范围. 依照上述方法继续检查90%,80%,70%等各浓度的F值,在70%F值为1.2,P>0.05, 故可判定该仪器血红蛋白的线性范围可从3g/dl到21g/dl. 为了简化计算手续,可用血红蛋白测定值为纵坐标,血液浓度为横坐标做图,从接近回归线的点开始计算,远离回归线的点可以不去计算. 5.可比性 可比性是指一些血液学测定(如红、白细胞测定),尚无参考方法, 因此要评价新仪器只能将所得结果与常规方法所得结果相比较,如一致即为与常规方法有可比性,以测定10例白细胞对比结果为例(表6-7),设被评价仪器测定结果为P,常规测定结果为Q,二者之差d=P-Q,计算如下: n=10, ∑d=0.5, ∑d2=1.11 ∑d d--=──=0.5/10=0.05 n s2d=[∑d2-(∑d.∑d/n)]/(n-1) =[1.11-(10.5×0.5)/(10-1)=0.12 Sd=0.34 t=d--n/sd=0.05×--10/0.34=0.46 自由度=n-1=10-1=9 查t值表,P>0.05,证明评价的仪器与常规方法有可比性. 6.准确性 准确性指测定结果与真值一致,真值必须用决定性方法或参考方法才能测得.血红蛋白可用ICSH推荐的参考方法作比较,测定100份未经选择的标本, 将其结果与HICN分光光度法测定结果进行比较,然后用配对检验进行处理.具体方法和HICN可比性相同. 表6-7 仪器测定与常规测定白细胞结果统计表 ──────────────────────────── 结果(×109/L) 标本号 差值d p Q ───────────────────────────── 1 7.5 7.8 -0.3 2 12.2 12.5 -0.3 3 3.4 3.4 0 4 18.7 17.9 0.9 : : : : : : : : 10 5.7 5.9 -0.2 ──────────────────────────── （四）仪器的校正： 　　理想的仪器校正方法是取一份新鲜血液，经ICSH推荐的方法定值后，用其校下仪器的各项参数，以下介绍几种方法操作及注意事项： １。ＨＢ测定──氰化高铁血红蛋白测定法； 　　（１）HiCN法的优点 HiCN法之所以被选为国际标准法,是因为其具备以下几个重要的特点:A.操 作简单,稀释液(试剂)为单一试剂.B.除SHb外其余Hb衍生物均可很快转为HiCN.C.HiCN在5540nm处吸收峰 较宽,可用一般分光光度计或滤光板比色计比色测定.D. 显色快而稳定,因此HiCN液可制成相当长时间(至少六年)稳定发生 不变的标准液.E. 可以通过比色 直接定值. (2)实验原理 血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白再与氰结合成稳定的棕色氰化高铁血红蛋白,在规定的波长和液层厚度的条件下具有一定的消光系数.因此, 根据其消光度,即可求得HB浓度其化学反应式为:Hb+?K3[Fe(CN)6]-Hi;Hi+CN- -HiCN (3)试剂 经典的HiCN法的二种常用试剂其配方为: 都氏液:KCN(50mg),K3[Fe(CN)6](200mg),NaHCO3(1g); 文-齐氏液:KCN(50mg),K3[Fe(CN)6](200mg),KH2PO4(140mg),storoX-100(5ml); 从配方可以看出,两种液基本成份一致,唯PH不同,都 氏液含有 PH8.5远离病理性血红蛋白（大多属于优球蛋白）的等电点，因此，检查这些病人时不易产生混浊，但反应时间过长（多数４０分钟才能比色）为其不足。反之，用文齐氏液　因ＰＨ较低，反应较快，３分钟后即可比色，但因其ＰＨ接近于病理性血清蛋白等电点，易产生混浊。目前国内外常用文　齐氏液做为常规使用。 （４）计算　 　　因为HiCN在规定的　波长和液层厚度下，具的一定的消光系数（消光系数为４４）因此，测试条件都在标准状态时（仪器、比色杯、试剂稀释器）根据样品光密度即可求出Hb量。公式为: OD 64458(mg) ------X──── X251=ODX36.77=Hbg/l 44 1000 (5) 有关HiCN质控 注意的问题 A.HiCN法优点之,就是通过比色可直接定值,即HICN比色光密度值X36.77,但使 用36.77这个常 数是有条件的, 即所测出光密度的分光光密度计波长范围必须十分准确,灵敏度高线好,无杂光,比色光程为1cm,衡释倍数为1:251.因此,仪器的校正是测定中珠关键,决定着测定结果的正确与否.校正分光光度计的方法很多,对于HiCN 测定最有效、最简单的校正方法是用特殊的ＨｉＣＮ标准校正液。因为这种液体有特殊的吸收光谱并可保持６　年不变。因此，用同批号的标准液即可根据其光谱特性标定仪器，又可用其稳定性去监测已标准的仪器。校正在致有以下几个步骤： 　　ａ。波长：因为标准液最大吸收是540nm,因此,可将校 正液放在等待测光度计中,从500至580nm分几个波段测量其OD值,最大吸收在540nm,证明仪器波长准确, 否则调试仪器有关部分.但在实际工作中对波长偏差不太大的仪器, 可采用“将错就错”的办法,即可用HiCN标准液所得吸收光谱的最大吸 收是535nm,说明535nm是偏差,实际上是540nm,实际工作中即可用535nm进行测定. b.灵敏度:并非所有的仪器灵敏度均能达到实验条件.因此使 用的721分光光度计必须经过“浓度换算”求出校正系数。 方法为：在质控部门购买一套标准HiCN校正液,具有5g、10g、15g、20g四种浓度。在标准的仪器上，这四种浓度的溶液OD值分别为0.153、 0.271、 0.407及0.543。将这四种溶液分别在待测仪器上比色，　即可得该仪器的测定光密度，然　后根据 　　　　￥OD(理论值)　 　　Ｋ＝────── 的公式求出该仪器的校正系数(K值). 常规工作时病人血光 $OD(测定值) 密度X36.77 X K值就是病人HB实际浓度. C.杂光:杂光的增加意味着单色光的纯度减低,因而使HICN在吸收峰处吸光度下降,504处形成波谷,是HB测定在一定范围内灵敏度最低的波长, 故杂光对其影响不大.因此杂光可使 HICN吸收光谱的Q值减低(见表一) 表一不同杂光水平的Q值 ───────────────────────────── 杂光水平 1.5 1.9 6.0 12.5 20 Q 值 1.6 1.59 1.55 1.47 1.38───────────────────────────── 因此观察标准校正液Q值,可了解仪器杂光程度. D.线性: 在仪器性能测定时,常用一种在一定波长范围内,确知其服从Bccr 定律的有色物质配成不同浓度来检查仪器本身是否能如实反映浓度变化, 这就是仪器的线性检 查.Hb测定用的分光光度计线性了也可用HiCN来检查. 方法是将已知浓度的HICN液准确稀释成各种浓度.分别比色,然后以每个稀释液浓度(g%)为横座标, 比色的光密主工为纵座标,交各点连线,如仪器性能好,各点连线应为直线.如有各别点不在直线上,作用时应使 直线通过尽量多的点, 交不在直线上的点光密度与所代表的浓度在直线的光密度比较,如两者之差在5%以内,则可认为仪器符合线 性要求. E.比色杯:比色杯的厚度及透光性是影响实验的又一因素.厚度可用卡尺鉴定, 若不是1cm,则比色结果应乘以校正系数1cm/厚度. 透光度可用下述方法测定. 溶解0.2MG伊文氏兰于100ml蒸馏水中,放入所有待测比色杯内,用一比色杯做标准,将仪器读数准确调 到50%T(透光度),将其它比色杯逐一与标准杯比较读数时应反复交替测定标准杯与待测杯的透光度,尽量减少仪器漂移的影响,比色杯透光度,在50%T++ 0.5%内者为合格,标记比色杯的透光面.以便在以后应用中,使 同一侧面向光源 . (二)试剂问题 1.测定某些含有病理性蛋白血液HB时,试剂的处理,前已述及,经典的HICN 法的试剂有两种,都氏液和文齐氏液.前者含NAHCO3:呈碱性,病理血液(肝硬变、白血病、 肾病)加入后不产生混浊，但需在１５ＯＣ条件下４０分钟后才使Hb完全转化成HiCN,文齐氏液虽显色快,但因是低离子强度溶液且PH 接近而产生混浊的病理球蛋白的等电点,围绕着上述问题许多学者做了深入的的研究,Vanzitti发现产生混浊的蛋白属于优球蛋白,,其特点是溶解度低,在低离子溶液中易沉淀.正常人血浆在PH4.5--6.5环境中可发生混 浊,而病 理血清可在PH>7.0条件下发生(见图一).进一步研究证实,如在试剂中加入NnCL增加其离子强度,可抑制这种混浊发生.但Mafsufoara发现加入NaCL虽可抑制沉淀,但因改变了HiCN的Q值影响了结果的准确性, 这种变化可以通过调 整KH2PO4的浓度 ,改变PH范围,使Q值仍保持在正常范围内, 即在NaCL 浓度为0.50g/L时应加入KH2PO430-180mg/L;60-160mg/L;100-180mg/L,使PH在6.5-9.5;6.5-8.5;6.5-7.2范围,可使Q值在1.59-1.63范围内(见图二).改变的文齐氏液与病理血液的结果见表二. 表二 文齐氏液与病理血结果比较 ─────────────────────────────── 都氏液 文齐氏液 含5g/L 含 50g/L ────────────────────────────── 浊度 Q值 浊度 Q值 浊度 Q值 浊度 Q值 骨髓瘤 ++ 1.53 ++ 1.54 - 1.59 - 1.59 肝硬变 ++ 1.54 +++ 1.54 - 1.59 - 1.58 肝炎后再障 ++ 1.43 +++ 1.16 - 1.57 - 1.58 慢性肾炎 + 1.54 +++ 1.45 - 1.58 - 1.17 肺脓肿 ++ 1.57 ++ 1.57 - 1.59 - 1.59 ───────────────────────────── 2.对HbCO转化问题:Bcrcns等报道HbCO的存在, 可影响测定结果, 因为HbCO 转化为HiCN缓慢,有时几小时转化还不完全且HbCO在540nm时的毫克分子消光系数经HiCN大32%,在吸烟者(血中HbCO浓度高达20%)或接触CO者测量Hb时,可使结果偏高. Taylor提出延长转化时间至3小时或将试剂中K3[Fe(CN)6]浓度加大5 倍(可转化时间缩短5分钟)均可得到满意结果. 3.试剂合格的指标:(1)处观应为淡黄色透明液体,如有变混 变绿南侬象,即不能用. (2)PH低于7.0时应进行调整,否则与Hb混合引起混浊,同时Hi不易与CN结合,而KCN容易分解,以HCN形成散失.(3)在波长540nm处光径为1cm以水作空白,试剂A(OD)=0(4) 都氏液较稳定,40C 条件下可保存一年,文齐氏液不易长期保存,应放在棕 色的玻璃瓶中,冰箱保存,但不能结冰. 4 对含KCN的商品试剂的使 用:以上为们介绍的HiCN的操作、计算针对的是经典的HiCN即血与文齐氏液或都氏液混合后的HICN不是对所有的含KCN试剂都适用.已经证明,目前国内处出售的某些商品试剂虽然含KCN,但实际产物并非HiCN 如有些商品试剂内含溴代十六烷,KCN及一些表面活性剂,其与血液反应的产物光谱特点与HiCN 不同,此时结果计算就不能用36.77这个常数. 人体末梢血白细胞计数(下称WBC)是临床工作中最常用的实验指标, 它对于疾病的诊断,特别是血液病的诊断与治疗具有重要的临床意义.因此,搞好WBC的质控工作,减少实验误差,是临床实验室的一项重要工作,本文拟就显微镜目测法及血液分析仪计数法白细胞计数的质控工作介绍如下,供同道门参考. 目测显微镜计数法 一 目测WBC计数法误差及质量控制 目测WBC计数法同其他实验方法一样,不可避免地存在着实验误差, 这种误差大致分成技术误差和固有误差.前者又 一般说来, 技术误差主要由于实验操作人员的技术素质和思想素质及实验条件决定的,这种误差随着工作人员的技术水平的提高,责任心的增强及仪器. 试剂的标准化是可以逐步地减低,甚至是可以避免的.固有误差是实验方法本身存在的, 即使技术熟练者,使用同一仪器,用同一稀释液多次充液计数,结果也常有一定差异.临检的质控目的就是通过各种措施避免技术误差,使固有误差减低到最低程度. (一)随机误差的质量控制 随机误差是操作不正规或技术不熟练所引起的误差,这类误差通过主观努力, 即可避免或显著缩小. 1 标本的稀释:原则上无论全自动或半自动,仪器校正时均应使静脉血,取样时, 血液跟抗凝剂应充分混匀,抗凝剂的比例要合适,取血管及试剂吸管均应校正, 血液加入后与试剂应充分混匀,并放置15分钟后进行充液计数. 2 充液应注意的问题: 充液质量直接影响WBC的准确度.合格的充液应注意下面几个问题: (1)混匀:充液前,稀释液的混匀是相当重要的.混匀程度与混匀力,粒子质量, 混匀速度诸因素有关.实验证明适当用力,快速震荡30"即可达到混匀目的.(见表二) (表二) 不同时间混匀后计数结果(CV)比较 ─────────────────────── 标本 30" 60" 90" 120" ─────────────────────── 1 7.3 8.5 8.3 2 8.0 7.9 8.3 3 7.4 7.6 7.4 7.9 4 6.1 6.3 6.3 5.9 5 4.8 5.2 4.8 4.9 6 7.0 7.4 7.2 7.6 ─────────────────────── 有人认为:为了使血细胞充分混匀,在震摇后出现少许气泡一般不会影响结果, 但摇出过多气泡现象仍要避免,因为气泡越多,粘在管壁上的血液混悬液就越多, 水分蒸发就越快,这样如需再次冲池复查结果就可能受到影响. (2) 加盖片方式:加盖片方式不同,可影响充液的高度,WHO推荐应采用"推式" 盖片法,认为此法较"盖式"更能保证充液体积高度为0.1mm. 有人报道同一组实验对象同时分别用"盖式"和"推式"计数,结果前者X为8400/mm3有显著统计学差异. (3)细胞分布误差: 即使高明的实验技师也不可能充液后四大方格分布细胞数一致,这是由于实验的固有误差决定的.那么,四大方格之差在多少范围之内,可保证数据可靠呢?有人根据实验得出了充液细胞分布标准(称RCS)(表三) (表三) 不同白细胞总数RCS标准 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 白细胞总数 RCS ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ <4000 30%-20% 4100-14900 20%-15% >15000 <15% ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 因为四大格分布固有误差直接受白细胞总数的影响,因此RCS 较机械地固定四大格之差作为分布标准更能反应客观实际.RCS的计数方法为: 四大方格最大值-四大格最小值 RCS=━━━━━━━━━━━━━━━ X 100% 四大个平均值 3 有核红细胞增多症患者应注意结果校正 白细胞稀释液只能破坏成熟红细胞,在末梢血出现有核红细胞的患者, 应注意结果的较正.方法为:在计数100个白细胞时,同时计数有核红细胞,然后根据下述公式,报告修正值. 100 校正后值=━━━━━━━━━━ X 白细胞计数值 100 + 有核红细胞数 4 实验人员的正规操作是准确计数的关键.采血量要准,吸血要快,放血要慢, 取血要防止用力挤压,以免混入人组织液使血液凝固.有人报道第三滴以后的血液, 白细胞计数趋于稳定.充液过多,断续充液,产生气泡或充液后盖片移动,均可使细胞分布不匀,使计数结果偏高或偏低. (二)系统误差的质控 目测法WBC计数的系统误差来源于沙利氏吸管,计数池及盖玻片的标准.微量管须用水银法检查校正,误差应<+1%,计数池的深度可用分卡尺法测定,误差应<+2%,计数室面积可用测微尺测定,每大格边长误差应<+1% 盖玻片应为专用血球计数盖片( 约24X20X0.6mm), 要求两面平整光滑, 高倍镜检无裂隙, 两面光单平面误差应< + 0.002mm.也可用简易的旋转吸附法检查盖玻片的质量. (三)固有误差: 目测法WBC固有误差是白细胞在计数室分布不均造成的.据统计学研究,血细胞在计数室内的随机分布符合泊森式(Poison)分布,其标准差SD=ｍ,其变异系数 SD m 1 CV=─ X 100%=─ X 100=─ x 100% m m m 上式表明CV与M成反比,即M值越大,CV值越小.计数范围越大,计数细胞越多, 误差越小.因此,白细胞计数区域一定数四个大方格,那种"数两个大方格乘100"的操作,扩大了CV值是不可取的.在白细胞减少症患者要取两倍量血液计数, 保证结果准确性,根据Berkson实验证明,固有误差应包括计算细胞数,吸管,计算板三个方面,认为同一样本多支吸管稀释, 在多个计算板计数较同一稀释液在同一计算板同样次数计数所得值更接近真值水平.其计算公式为: 100 2 4.6 4.7 CV=─── + ── + ── nb nc np 公式中nb为所见细胞数目,nc为计数板数,np为吸管数. (四)仪器的校正 理想的仪器校正方法是取一份新鲜血液,经ICSH推荐的方法定值后, 用其校正仪器的各项参数,以下介绍几种方法的操作及注意事项. 1 Hb测定─氰化高铁血红蛋白测定法 2 白细胞计数─显微镜目测法 3 红细胞比积─微量法 (五) 测量参数的正常参考范围 仪器使用前, 操作人员及临床医护人员应掌握仪器对结果的表示方法及正常参考范围,此方面应注意以下三个问题. 1 实验数据单位的表示: 机器打印的结果多用SI 制, 即白细胞和血小板用XXX10 9/L表示,红细胞用XX X10 12/L表示,这里特别需指出的是,109和1012希腊文分别为giga,tera,可缩写为G和T,因此白细胞4X109/L也可写为4G/L, 红细胞5X1012/L也可写为5T/L,血小板100X109/L也可写为100G/L,这一点临床医生应十分清楚. 2 由于红细胞在静脉血和末梢血分布的不同,因此,所得测定值也有差异. 下面两表显示了同一组对象不同部位所得的结果. 北京市2013例正常人静脉血液各种细胞成份正常参考值调查结果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ WBC MCV MCH MCHC RDW PLT MPV PCT PDW ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ n 2013 2013 2013 2013 2013 2013 2013 2013 2013 X 6.48 89.05 30.83 344.8 13.12 200.8 10.4 0.2 1.6 SD 1.57 4.52 1.81 7.76 1.13 52.1 1.4 0.043 0.64 范围3.4-9.55 80-98 27-34 329-360 <15.4 98-30.2 7.6-13.1 1.2-2.8 <2.8 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 北京市2013例正常人静脉血红细胞血红蛋白正常参考值调查 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ R B C Hb Hct ━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━ 男性 女性 男性 女性 男性 女性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ n 1013 1000 1013 1000 1013 1000 X 5.08 4.47 158.3 136.2 0.459 0.397 SD 0.4 0.36 10.7 10.01 0.03 0.039 范围 4.3-5.86 3.7-5.25 137.2-179.4 116.6-155.8 0.4-0.52 0.32-0.473 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 3 目前国内专家多次 ,使用血液分析仪应尽量使用静脉血, 由于仪器的测量方法与手工法不同,静脉血和末梢血红细胞分布有异,因此, 使用静脉血在自动仪器上所得结果与过去手工法所得结果有所差异,分析结果时应予注意.下表是北京市协作组调查200例正常人静脉血所得的结果. 4 网织红细胞正常参考范围 九十年代以来, 网织红细胞计数仪或可兼作网红的高档血液分析仪可进行网织红细胞计数并可得出多项参数,为临床提供了全新的实验指标,文献报道, 仪器网红计数正常值为网红占红细胞总数为 ,其中HFR(幼稚网红) ,MFR(成熟网红) ,LFR(衰老网红) ,我们对64例正常人用Technicon H3进行了网红分析, 结果见下表. (六) 对于测量参数临床意义的理解 无论是实验工作人员还是临床医师都应对实验参数的临床意义有深刻的理解,以期实验室能更好地做好分析后质控工作,临床能更合理地利用,正确地选用每一项实验及对实验结果有正确的判断.有关WBC,Hb,RBC,Hct的临床意义众所周知,不再赘述,以下就分析所得的各项参数作简单介绍. (1) MCV,NCH,MCHC检测临床价值 此三项指标是仪器经过Hb,RBC,Hct三项检测后,经计算机计算后所得的指标,气主要临床意义是根据三项结果,可能有下表四个组合,每一组合可能是由于不同病因引起病人红细胞相应的形态变化,借此,可辅助临床医生对贫血作出鉴别诊断. 2 由于上述指标是平均指标(mean),只反应;平均大小,并不能反应个体形态本质变化,比如,MCV是90fl,可能有两种情况,一种为89fl+91fl/2= 90fl, 另一种可为害0fl+110fl/2=90fl,MCV同为90fl,显示头者为生理性大小不等,而后者明显为病理性.因此,在八十年代就设计了一项反应红细胞大小不等的客观指标.即: RDW. RDW 是Red Blood Cell Volume Distribution width的缩写,释为红细胞体积分布宽度,是通过自动血液分析仪测量获得的,用所测红细胞体积大小的变异系数表示(也有的仪器用SD表示),其主要临床意义为 血小板计数及MPV检查 MPV(mean platelet volume)表示血小板平均体积,其对止血及血栓性疾病的诊断及治疗有一定临床意义.但MPV与血小板数(PLT)关系非常密切,无论是正常参考值还是病理标本,MPV应结合PLT变化综合分析. 1 MPV正常参考范围:Bassman测量68例正常人PLT和MPV,发现正常群体中,MPV是随血小板数不同,MPV而不同,两者呈负相关关系(见图1) 2 MPV和PLT结合,对止血与血栓性疾病的鉴别诊断有一定价值.(见图 表) 3 MPV其它方面的临床价值 (1) MPV有助于区别周围PLT破坏和骨髓损伤所致的PLT减少,前者MPV 增加而后者MPV下降. (2)Small和Beuigole认为MPV及PLT变化有助于骨髓增生病与反应性PLT 增加的鉴别. (3)因为MPV先于PLT变化,因此,可用于观察病情变化,白血病化疗时, MPV 上升是BM恢复的第一征候,在感染时,VanDer Lelie等认为局部炎症MPV正常而败血症时,则一半有MPV增加.并认为MPV持续低,说明感染未受控制而继续抑制PLT生长.如MPV 随PLT数持续下降则为骨髓衰竭的征兆.越小越严重,直到MPV上升,PLT才恢复. (4) Ekder每日测MPV并观察KPTT,PT,TT,FDP,观察出血素质病人变化,发现有出血倾向者MPV显著低于无倾向者,即使严重PLT下降者,如MPV>6.4fl出血发生率也低. (5) Thompson研究结果表明MPV与PLT体外功能之间明显相关, 对胶原和凝血酶诱导的PLT聚集,其速度及程度随MPV增加而增加. (七)标本的采集和运送 血液分析仪一般要求用抗凝的静脉血,皮肤穿刺采血尽可能不用,因为不同部位皮肤穿刺血的细胞成份和细胞与血浆的比例常不一致,与静脉血的差别则更大,从技术角度讲,毛细血管采血量较少,特别对一些全自动的仪器,不易采到足够量,更不能在有疑问是重复检查,因此,除了少数不易取得静脉血,如婴儿,大面积烧伤以及某些需要经常采血检查的病例,如血液病,肿瘤化疗等以外,均应用静脉血实验. 采血容器,发达国家为了保证血液质量,防止操作者受血行感染, 多用真空采血系统,既有血液分析达到自动化又对质量控制及保证操作者安全均有裨益.应逐步在国内推广使用,但由于价格昂贵,迄今难以普及. 国内急需开发价格低廉又能保证其功能和质量的产品. 2 抗凝剂:1993年ICSH推荐用EDTA二钾,其含量规定为:1.5-2mg/ml 血此抗凝剂不影响白细胞数目及大小,对红细胞的形态影响也最小,而且可以抑制血小板的聚集, 文献报道及我们的试验都证实EDTA盐抗凝血在采血1小时内,MPV 较即刻检查有明显升高,1小时后基本恒定,1-8小时各点比较恒定,随时间及温度变化不大,尤其在室温条件下,几乎成为一条直线.因此在某些病例,特别是动态观察MPV变化时,应予注意.我们的实验证实,EDTA二钠对CBC检查较EDTA二钾抗凝血无明显变化(见图,表). 且试剂价格低廉,但其溶解度较低,不适合利用于指血在小试管内抗凝的标本. 3 血液的贮存 上述抗凝血在室温下,WBC,RBC,PLT可稳定24小时,白细胞分类可稳定6-8小时,血红蛋白可稳定数日.但镜下白细胞分类,二小时后粒细胞形态即有变化,故需作镜检下分类者,应及早推制血片.虽然4C条件可延长血液贮存期,但血小板不宜在低温下贮存,因会影响PLT和MPV值,故如不能及时检验时,血液应在室温保存. 4 在使用半自动血液分析仪,血液需经予稀释后方能检验,此时应特别注意稀释溶血现象,所谓稀释溶血是指血液经高倍数稀释后,随着放置时间的延长, 血细胞自行溶解的现象.图 显示的是血液经1:5000和1:500倍稀释后不同时相,稀释溶血的变化.故稀释血液后应尽快测定,否则RBC不准,进而又可影响Hct,MCV,MCH及MCHC的测定.为了避免此种现象,也可使用特别的附着 :5000和1:500倍稀释后不同时相,稀释溶血的变化.故稀释血液后应尽快测定,否则RBC不准,进而又可影响Hct,MCV,MCH及MCHC的测定.为了避免此种现象,也可使用特别的附着