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利用黄疸血清信息测定血清总胆红素
黄文东 喻雄文 高玲
摘 要 目的：利用HITACHI生化分析仪血清信息功能中的黄疸血清信息法测定血清总胆红素。方法：用HITACHI-7170全自动生化分析仪上提供的血清信息功能中黄疸血清信息与总胆红素浓度有显著相关原理测定血清总胆红素。结果：该法与重氮法对比r=0.997，t=1.284，P＞0.05；黄疸血清信息测定总胆红素在550 μmol/L范围内呈线性；平均回收率为101.5%；精密度测定，批内CV3.2%，批间CV3.9%；当Hb＜30 g/L，Tg＜10.9 mmol/L时对该法干扰甚微。结论：该法精密度、准确度良好，简便易行，试剂价廉，有推广价值。
关键词 血清信息 总胆红素测定 干扰
Application of Icteric Serum index for determining the Serum Total Bilirubin
HUANG Wen-Dong
(Department of Laboratory Medicine，the hospital of Chen Xing-Hai Zhongshan 528415)
YU Xong-Wen GAO Ling
(The First Affiliated Hospital of Sun Yat-an Medical University)
Abstract Objective Application icteric serum index of serum index function for determinig the serum total bilirubin in HITACHI-7170 Autoanalyzer.Method Using the principle of significant relativity between icteric serum index in HITACHI-7170 Autoanalyzer and serum total bilirubin to detect serum total bilirubin.Results To compare this method with jandrassikgr of method,r=0.997，t=1.284 and P＞0.05.Detecting bilirubin under the TBIL＜550 μmol/L concentration with Icteric serum index,the average recovery rate was 101.5%,inter-run CV was 3.2% and intra-run CV was 3.9%.There was no interference under the Hb＜30 g/L and Tg＜10.9 mmol/L.Conclusion The method have good speciality,tobe convenient and cheap.
Key words Serum index Total bilirubin Interference
目前，自动生化分析仪测定血清总胆红素多为重氮法，不能够排除溶血和脂浊的干扰，酶法测定胆红素也同样受溶血和脂浊的干扰，且成本也较高，为此作者利用HITACHI-7170全自动生化分析仪上提供的血清信息功能中的黄疸血清信息法测定血清总胆红素，效果满意，现介绍以下：
1 原理 血清信息是对血清的脂浊(Lipemic简写L)溶血(Hemolytic简写H)、黄疸(Icteric简写I)程度的测定〔1〕，用Tris-HCl缓冲液分别与胆红素标准、血细胞溶血液、混浊标准按一定比例混和，在不同波长扫描其吸收光谱，得出各种血清的干扰图谱(图1)。在HITACHI-7170生化分析仪上利用血清信息测定功能在同一反应杯中分别在波长(主/次)480/505、570/600、660/700 nm测定L、H、I的吸光度EI、EH、EL。I校正=(ΔEI-E×(ΔEH-B×ΔEL)-F×ΔEL)/D，其中B、E、F是一吸光光谱中求出的溶血、脂浊对黄疸血清信息干扰的补偿系数，用于校正溶血和脂浊对本法测定胆红素的干扰。D是把黄疸血清信息值换算成总胆红素浓度时的校正系数，当D=1、EL=0、EH=0时(标本无溶血无脂浊时)，I校正=总胆红素的吸光度(ABS=×104)。
2 材料与仪器
2.1 自配Tris-HCl缓冲液(pH7.4)。
图1 黄疸、溶血、混浊血清吸光光谱
2.2 胆红素标准品 重庆东方红试剂厂提供。
2.3 自配血细胞溶血液 生理盐水洗涤人血红细胞三次用AC920血细胞计数仪测定Hb=60 g/L。
2.4 混浊标准intralipos 日本十字社提供。
2.5 重氮法胆红素试剂盒 上海科华公司提供。
2.6 HITACHI-7170生化分析仪。
2.7 722分光光度仪。
2.8 维生素B2；连二亚硫酸钠。
3 实验与结果
3.1 参数设定 采用血清信息功能，以Tris-HCl缓冲液为试剂，设定一个带血清信息功能速率A法的测定项目，波长为340 nm，样品吸量为10 μl，试剂吸量为200 μl，测定时间为3 min，设定好血清信息参数B=83 000、E=9 800、F=150 000(此参数出厂前已调好)，D参数用80 μmol/L的纯胆红素标准校正，并选自项目为血清信息项目，仪器会自读入(主/次)480/505、570/600、660/700 nm六个波长，3 min内分别用六个波长进行扫描同一个反应杯，并自动进行计算L、H、I的值。
3.2 线性 用氯仿稀释系例浓度的胆红素标准液：0，5，10，20，40，80，160，320，550，640 μmol/L，测定I校正，以I校正为纵坐标，胆红素浓度为横坐标求得(图2)胆红素在550 μmol/L内成线性，回归方程为I校正=0.99×C胆红素+0.52。
图2 胆红素浓度与I值线性关系
3.3 准确性 用重氮法(1为单试剂未去样品空白，2为双试剂去样品空白)及本法分别测定BIO-RAD质控血清三次求均值如表1。
表1 胆红素测定准确度试验(μmol/L) |
| 质控血清批号 |
靶值 |
重氮法1 |
重氮法2 |
本法 |
L：BIO-RAD1431
H：BIO-RAD1432 |
16.0
79.0 |
19.2
86.0 |
16.1
78.8 |
15.9
79.3 |
3.4 重复性 用本法分别测定BIO-RAD高低值质控血清(批号为H：BIO-RAD1432靶值为79 μmol/L，L：BIO-RAD1431靶值为16 μmol/L，n=20)批内CV2.9%、3.2%；批间CV为3.5%、3.9%。
3.5 回收率 用两份混合血清(本法测定胆红素浓度为40.2和450 μmol/L)作回收试验，求得平均回收率为101.5%。
3.6 干扰试验
3.6.1 溶血干扰：取无溶血的样本加入等体积系列的溶血液，以本法测定高低值总胆红素标本，结果见表2。
3.6 脂浊的干扰 取无溶血的样本加入等体积系列浓度脂浊液作为干扰实验，测定高低值总胆红素标本，结果见表3。
3.7 对比实验 用本法(Y)与重氮法(X)同时测定300份无溶血无脂浊的标本，总胆红素在5.2～250 μmol/L，经回归分析和配对t检验，t=1.842，结果r=0.997，P＞0.05，两法无显著差异，Y=0.98X-1.62。
表2 溶血对本法的干扰实验(测三次求均值) |
标本编号
(标本/标本) |
胆红素浓度μmol/L
(低值/高值) |
血红蛋白浓度g/L
(AC920血细胞计测定) |
干扰值
μmol/L |
1/6
2/7
3/8
4/9
5/10 |
10.7/200.5
10.6/201.0
10.8/201.1
11.0/202.2
11.1/203.2 |
—/—
1.8/2.0
6.5/8.6
12.0/15.0
27.0/30.0 |
—/—
-0.1/0.5
0.1/0.6
0.3/1.7
0.4/2.7 |
标本编号
(标本/标本) |
胆红素浓度μmol/L
(低值/高值) |
Tg终浓度mmol/L
(GPO-PAP法测定Tg) |
干扰值
μmol/L |
1/5
2/6
3/7
4/8 |
10.7/200.5
10.7/200.2
10.6/199.0
10.5/198.6 |
—/—
1.8/2.0
5.7/6.5
9.5/10.9 |
—/—
0.0/-0.3
-0.1/-1.5
-0.2/-1.9 |
4 讨论
4.1 目前，测定胆红素常见方法有重氮法和酶法，在临床检验实际工作中，两种方法测定血清总胆红素受溶血和脂浊干扰〔2，3〕，其脂浊的干扰最为明显〔4〕；血红蛋白干扰胆红素的测定中，国外杂志报道〔5〕：当胆红素浓度小于32.5 μmol/L时为正干扰，大于32.5 μmol/L时为负干扰，等于32.5 μmol/L时无干扰；重氮法测定总胆红素时，溶血对总胆红素的干扰国内袁水斌等也作出报道〔6〕。然而，随着全自动生化分析仪的普及使用，溶血和脂浊的外观检查逐渐被检验人员忽视，造成总胆红素结果的严重错误!且溶血和脂浊的现象在临床标本中并不少见，而此类血清标本总胆红素的准确测定在国内未见有很好的参考方法。
4.2 本法测定血清总胆红素是在分光光度法的基础上分别利用双波长测定血清黄疸、溶血、脂浊，并根据三个数值大小计算总胆红素的含量。国外文献报道〔7〕：I值与总胆红素显著相关，r＞0.99；胆红素=0.994×I+0.2。因此本法可用于临床工作中，凡是带有血清信息功能的生化分析仪都可采用本法测定血清总胆红素，如HITACHI系列，岛津系列等。优点是操作简便，测定时间短，线性范围宽，准确性和重复性良好，可避免溶血和脂浊的干扰，作者建议样本与试剂比例为1∶20为最佳比例。本法利用分光光度法的原理，同时使用六种波长，其中480/505 nm测定总胆红素的吸收，570/660 nm测定血红蛋白的吸收〔1〕，660/700 nm测定脂浊的吸收〔8〕，当测定既溶血又混浊的总胆红素标本时，480/505 nm的吸收并非是纯胆红素的吸收，是三种物质的混合吸收，真正的胆红素的吸收应该是减去溶血和脂浊影响之后的吸收，这是一般分光光度法未能解决的问题之一。以往认为一般分光光度法直接测定血清总胆红素，易受胡萝卜素的干扰，但胡萝卜素在体内可转化成维生素A〔9〕，而维生素A在Tris-HCl缓冲液在480/505 nm中吸收甚微〔10〕；维生素B2对本法有一定的正干扰，但在体内含量很低，在试剂中加入少量的连二亚硫酸钠可消除维生素B2的颜色〔11〕；食物中有些黄色色素对本法有一定的正干扰，空腹抽血可消除外源性色素的干扰。新生儿溶血性黄疸标本的总胆红素测定，本法优于酶法和重氮法。在实际工作中，胆红素对显色反应的生化项目有一定负干扰，特别对尿酸的测定干扰特别明显，应用I值校正黄疸对尿酸测定的干扰就可准确地补偿尿酸的含量〔12〕。血清I值的其它方面的应用有待进一步的研究。因此，笔者认为，以黄疸血清信息代替重氮法测定血清总胆红素在临床检验中是可行的。
黄文东(中山市陈星海医院检验科 528415)
喻雄文(中山医科大学第一附属医院检验部)
高玲(中山医科大学第一附属医院检验部)
参考文献
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