[转帖]单克隆抗体的制备和鉴定

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。 利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。 1．材料　　（1）经高压灭菌的降植烷。　　（2）Balb/c鼠：5~8周龄。 （3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。 （4）RPMI—1640培养液 （5）新生牛血清 2．操作方法　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。　　(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。 (3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。 (4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。 (5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。 单克隆抗体的提纯 1．材料 (1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液 20 mMol/L NaCl (2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液 40mMol/L NaCl (3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液 80 mMol/L NaCl (4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液 (5) 饱和硫酸铵液 DEAE—纤维素柱 2．操作方法 （1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。 （2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。 （3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。 （4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。 （5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。 （6）离心去沉淀。 （7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量 1A 280unit=0.8mg蛋白质 一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。 （8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。 样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。 测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。 杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。 单克隆抗体的鉴定 1．杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋水仙素裂解法进行。 2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。 3．单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。 4．单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定