[转帖]阵发性睡眠性血红蛋白尿症的实验室诊断

阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种后天获得性造血干细胞基因突变引起的溶血性疾病,异常血细胞因缺乏一组通过糖肌醇磷脂连接在细胞表面的膜蛋白(GPI),导致性能发生变化。临床可表现为血管内溶血、栓塞、全血细胞减少，有时可出现骨髓衰竭。由于大多数 PNH患者病态细胞与正常细胞同时存在，使得本病的诊断比较困难。近年来，随着对PNH的发病机制的深入研究，检测技术取得了突破性的进展。现就PNH的实验室诊断技术综述如下。

　　1 初筛试验

　　1.1 尿含铁血黄素试验(Rous试验)

　　PNH属于血管内溶血，所以造成大量血红蛋白随尿液排出，当这些尿液经过肾脏滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，当细胞脱落时,随尿排出即成为含铁血黄素尿。这些铁离子可与亚铁氰化钾作用产生沉淀反应，Rous试验是通过此原理检测含铁血黄素尿。Rous试验阳性可提示慢性血管内溶血，且无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血，本试验结果均呈阳性。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，但上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时试验呈阴性反应。

　　1.2 热溶血试验

　　本实验是将患者的红细胞与自身含补体血清，在37 ℃下孵育。由于葡萄糖分解产酸而使血清酸化，使对补体敏感有内在缺陷的红细胞溶解，此试验方法简便，易行。保温6 h其溶血常超过500 mg／100 ml血液。正常人无溶血发生，其他溶血性贫血患者溶血少于100 mg／100 ml血液，一般低于50 mg／100 ml血液。自身免疫性溶血性贫血此试验也可阳性，但阳性率比PNH低。

　　1.3 糖水试验

　　PNH患者的红细胞在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强,经孵育,补体与红细胞膜结合增强,蔗糖溶液进入红细胞内,从而导致渗透性溶血。本实验敏感性高，约有88％的PNH呈阳性反应。日本学者认为该试验是最好的初筛试验。但本实验的特异性稍差，在自身免疫性溶血性贫血和巨幼细胞性贫血时可出现假阳性反应。

　　2 传统确证试验

　　2.1 酸化血清溶血试验(Ham试验)

　　1937年Ham建立的酸化血清溶血试验曾一度被国外作为PNH的唯一确诊试验。该试验原理是由于PNH病态红细胞在pH 6.4的条件下易被替代途径激活的补体溶解，而正常红细胞不被溶解，无溶血现象。本实验有较强的特异性。但球形红细胞会出现Ham试验假阳性。张之南等通过研究发现,不能因Ham试验的一次结果而否定诊断,因为同一患者初次及随后Ham试验检查结果可以不同。在作者所研究的病例中,只有一部分患者Ham试验持续阳性。对于Ham试验阴性者,有作者认为除青壮年外,其他溶血的原因找不到缺铁原因的要反复检查Ham试验,还要结合其他诊断方法。

　　2.2 蛇毒因子(CoF)试验

　　是用从眼镜蛇中提出的一种蛇毒因子，它本身没有溶血作用，但可在血清成分的协同下通过替代途径激活补体，在这种体系中PNH的异常红细胞被溶解。有作者通过研究提示CoF溶血试验可作为地中海贫血、自身免疫性溶贫、缺铁性贫血与PNH的鉴别诊断试验之一。此试验在某种程度上比Ham试验敏感，比糖水试验特异性强。该试验操作简便、经济。对某些临床上表现为溶血，而Ham试验阴性的病例，是一种有助于提高诊断的好方法。

　　2.3 补体溶血敏感试验

　　用冷凝集素或抗人红细胞膜抗体致敏红细胞，通过经典途径激活补体，观察能使红细胞溶解所需要的补体量，判断红细胞对补体的敏感程度，可将PNH红细胞分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。每例PNH患者的三型细胞，其比例不一，而且同一患者在病程的不同时期此三型红细胞的比例也不同，因此通过测定这三型红细胞所占的百分率，来了解患者病情的发展及治疗效果。本实验敏感性和特异性较高，但操作较繁琐。

　　3 新型确证试验

　　以上所介绍的为传统的PNH诊断方法,这些方法仅限于测定红细胞对补体的敏感度。只有在PNH患者外周血中受累的红细胞达到一定比例时,这些方法才为阳性。这样就造成部分PNH患者难以确诊。下面介绍的是近些年发展完善的诊断方法。

　　3.1 衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制物(CD59)的检测

　　PNH溶血发作的主要原因是红细胞膜表面缺乏补体调节蛋白，如CD55和CD59。使红细胞对补体敏感，且CD55，CD59存在于所有系列的血细胞中，并与临床表现关系密切。随着流式技术的发展，我们可以运用双色荧光技术检测PNH及其他血液病患者红细胞CD55和CD59。当PNH患者的CD59阴性细胞占3％时即可检出，较前所述方法敏感性高。在PNH患者的外周中CD59阴性红细胞所占的比例较CD55阴性细胞要高，故CD59单抗比CD55单抗在诊断时更敏感。在PNH克隆的发展过程中，首先累及的是粒细胞，其次为单核细胞和红细胞，最后为淋巴细胞。因此粒细胞CD59阴性最早检出，故粒细胞CD59的检测对PNH有早期诊断的价值，这比Ham试验阳性为早。另外，异常中性粒细胞的数量受输血的影响也较少。由于PNH的异常细胞起源于造血干细胞，当外周血尚无CD59阴性细胞时，骨髓中可能已经有CD59阴性细胞，因此检测骨髓比外周血更有意义。此试验方法虽特异性高，但流式细胞仪及CD55、CD59抗体价格较高。

　　3.2 嗜水氧单胞菌毒素(HEC)溶血试验

　　其原理是利用HEC毒素能特异性与细胞膜上GPI锚连接蛋白结合并立即聚合成多聚体，插入细胞膜的脂质双层，在膜上形成孔洞细胞使渗透压改变而使细胞溶解。由于PNH患者细胞膜上缺乏GPI锚连接蛋白，就不受毒素的作用。利用此原理通过测定红细胞的留存率来区分正常红细胞与异常红细胞，有研究证明通过实验确定红细胞的留存率正常人＜5%，PNH患者＞10%。并且发现不同PNH患者红细胞的CD59标记率与细胞对毒素的敏感性呈正相关。此方法比流式细胞仪更能准确的反映PNH病情，因为PNH表现为GPI蛋白缺乏，但不同细胞系所缺失的GPI蛋白的种类和多少并不相同，流式细胞仪只是依据CD59的标记率诊断PNH，而HEC毒素溶血试验则是特异性的作用于所有GPI蛋白，不会因为不同细胞表达GPI蛋白种类的多少和不同造成误差。但HEC毒素溶血试验测定的是成熟红细胞，一旦PNH克隆未发育至成熟红细胞就被溶解时，该实验就无法反映PNH异常克隆。而CD59标记可测骨髓细胞、外周血中性粒细胞，弥补了HEC毒素溶血试验的不足。此方法操作简单,费用比较便宜。
综上所述，上述各种诊断方法各有优缺点，在临床工作中要根据实验室的实际情况和病人的病情选择适合的方法，才能达到准确诊断的目的。