[原创][讨论][活动]五分类的计数与分类原理及实现

在目前国内众多的五分类血液分析仪当中，占有主流的依次是：光电、ABX、东亚，库尔特、雅培、拜尔（这个顺序纯属偶然，不代表任何排名）等，在今天的讲解过程中，我遵循先易后难的顺序。以下纯属个人观点，如有不当之处欢迎指教，谢谢！

MEK7222/8222 白细胞分类的测定原理

MEK-7222/8222，计数原理是wbc/rbc/plt电阻法，分类是使白细胞通过鞘流进入鞘流池内，然后通过检测对白细胞照射时发生的散射光，对白细胞进行分类。

这些散射光，根据血细胞的容积、血细胞的复杂性（有无颗粒、核的构造等）的不同，光的强度和方向有所不同，因此，通过以激光直进方向和同方向小角度的散射光（以下称为Size）、激光直进方向和同方向大角度的散射光（以下成为Complexity）、与激光直进方向相对垂直的方向的散射光（以下称为Granularity）为参数的散点图，可以对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞进行分类。另外，Size表示血细胞的大小、Complexity表示血细胞的复杂度、Granularity表示血细胞的颗粒的程度。

这种方法提供了三个散射图，MAIN散点图 NE-EO散点图 MO-BA散点图

Neutrophil Count(嗜中性白细胞)	NEC
Lymphocyto Count（淋巴细胞）	LYC
Monocyto Count（单核细胞）	MOC
Eosinophil Count（嗜酸性白细胞）	EOC
Basophil Count（嗜碱性白细胞）	BAC

散点图有下列三种。纵轴是Size、横轴是Complexity的散点图（以下称为S-C散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的单核细胞/嗜碱性白细胞分类用散点图（以下称为MO-BA分类用散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的嗜中性白细胞/嗜酸性白细胞分类用散点图（以下称为NE-EO分类用散点图）。

淋巴细胞分布在S-C散点图的LY区域。单核细胞及嗜碱性白细胞分布在S-C散点图的MO-BA区域。进一步展开到MO-BA分类用散点图时，则单核细胞分布在MO区域，嗜碱性白细胞分布在BA区域。嗜中性白细胞及嗜酸性白细胞分布在S-C散点图的NE-EO区域，进一步展开到NE-EO分类用散点图时，嗜中性白细胞分布在NE区域，而嗜酸性白细胞分布在EO区域。

通俗的说法是，这个分类原理只有三个角度，国内的介绍材料上说是4角度，这纯属误导，是把激光直射也算上了，在mek的官方材料上根本没有这个说法。在主散射图上就是淋巴lym，单核和嗜碱通道mo+ba, 中性和嗜酸通道 ne+eo,就是说在小角度光散射确定了体积的情况下结合大角度光散射能够测出的分群只有三个，其中淋巴是确定的。在mo+ba散射图上，清楚的分出了单核和嗜碱，就是说在小角度光散射确定了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，单核和嗜碱都是确定的，还有一个附属分类就是lic,即巨大不成熟细胞或者被称作为淋巴影子细胞，在这个仪器上并不单独出示lic数据。在ne+eo散射图上，清楚的分出了中性和嗜酸，就是说在小角度光散射确定了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，中性和嗜酸都是确定的。但是要说明是，我个人认为这五项分类当中有一项是计算出来的，而且，这个仪器在激光部分失灵或者五分类无法工作的情况下，应该可以充当三分类使用，因为wbc有着单独的计数通道，而且也出现wbc直方图，因此，有了直方图通过软件就可以进行分类的，但是官方没有具体的说法。

ABX PENTRA 计数分类测定方法及原理：

1、RBC/PLT: 电阻法 WBC/BAS计数：电阻法，由于采用差别溶解技术，WBC和BAS被一同计数出来，利用界标线进行判别，提供BAS直方图和WBC,BAS # %数值。

上图就是差别溶解之后取得的直方图，WBC总数就是图中WBC和BAS部分的总和，在BAS区域中由于数值很少 ，因此经常是空白，这时由于针式打印机无法细腻的打印出来的结果，如下图：

4、双鞘流（DHSS）分类计数，整个过程如下，血液标本进入LMNE混合池试剂混合形成混合溶液，孵育时间为12秒，这时RBC/PLT/BAS细胞已经被试剂破坏掉，在鞘流泵作用下进鞘流池进行双鞘流计数，首先经过红宝石孔进行电阻法计数，判断细胞体积，然后在200ms之内通过鞘流直径为42um的鞘流通道进行光吸收测定判断细胞内容物，整个计数时间为12秒。这样形成分类散射图，并提供lym,gra,mon,eo,lic,aly的绝对值和百分比。

双鞘流计数是abx的专利技术，详细原理如下：

根据上图可以看到，在进行双鞘流计数的时候，首先进行的是鞘流电阻计数，对细胞进行体积测定，然后再进行光吸收比率测定，对细胞内容物进行测定，最终将这个细胞在散射涂上标注出来，在双鞘流的上下两端分别加上恒流电源，以保证电阻法测量，孵育后的溶液在右侧鞘流泵的作用下经过6号口进入鞘流池从1号口流出，为了保证这些检测细胞能够正确的通过计数孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行矫正，这样，在5，7号口通过左侧鞘流泵注入稀释液来形成第一股鞘流，保护所测混合溶液能够直接通过计数孔并且保证其不发生偏移和扭曲，保证结果准确，混合溶液通过计数孔后，2，4口通过中间鞘流泵注入稀释液形成第二股鞘流，来保证吸光度测量的正常。

五、图形及其界标范围的设定：

分类图形及界标设定

上图是一个标准的分类散射图的样本，清晰的标明了各个细胞形态所处的范围和位置。因此，PENTRA 的双鞘流可以理解为电阻法加光吸收度测定，电阻法类似上面所讲的小角度激光测定体积，光吸收度测定就是测定形态，根据细胞染色原理，不同的白细胞染色后，细胞质和细胞核所形成的颜色不同，那么测定其通过去的光的波长可以知道其本身的颜色，因此这种方法一经问世，立即引起全世界范围的关注，特别是库尔特，库尔特认为这种方法如此简单成本和实现起来均好于库尔特本身的VCS技术，因此洽谈购买，但是ABX宁可自己实现起来结构不尽合理也不愿意出卖，因此就有了双方妥协的产物BACKMAN-COULTER ACT 5DIFF这个OEM ABX的五分类产品。在这一个电阻体积，一个吸光度测定的实现中，成功的分出了4项分群，LMNE既淋巴、单核、中性和嗜酸，并且还有两个附属分群，LIC和ALY既巨大不成熟细胞和异常淋巴细胞，在仪器状态良好和试剂过关的情况下，这6项分群及提示可靠性极高；由于细胞染色后单核和嗜碱很难被区分，所以，就有了前面的差别溶解技术的WBC总数和BASO的电阻法分群，因此以前的PENTRA宣传材料上有7分类之说，后来有些不严谨和炒作之嫌，改回现在的5+2分群宣传。顺便提一下，仅WBC分类图形是由一个散射图和一个直方图来实现的，如果加上RET的话，会增加三个散射图并增加一个水平90度的光散接受，这是单独给RET的。

SYSMEX的计数分类原理以XT1800/2000为例

RBC/PLT计数采用电阻法。LMNE和WBC/BASO均采用激光鞘流测定方式，下面解释这种方式，

上图是测试原理图示，官方的解释如下：

在小角度散射光测定中，可以得到细胞的体积（外径），作为散射光，并非从一点开始，而是细胞的全体，一定角度的散射光会重合，而另一部分没有重合的相对信号较弱，因此重合的散射光可以得到很强的信噪比，从而得到细胞体积的信息，经过反复试验，入射角度在1-6度为最佳，因为小细胞遇到的光散射小，大细胞散射光多，因此来区分的。

在大角度散射光测定中，光线照射在细胞核上发生散射，在一定角度下可以测的细胞核的信息，因此选定8-20度最佳角度可以得到细胞核信号的最佳信噪比，淋巴单核的细胞核较小，因此得到较少的散射光，中性粒细胞的细胞核比较大也比较多，因此得到的光散射也较多，因此来区分。

以上是小角度散射光的图示

以上是大角度光散射的图示

在xt1800/2000的机器中，不算RET可以得到2个散射图，并同时得到5项分群的全部参数。

在DIFF散射图当中可以得到LMNE四个分群，在WBC/BASO的散射图当中可以得到BASO的分群。

上图就是SYSMEX的WBC分群散射图

COULTER五分类测试原理和分类实现

COULTER的RBC/PLT /WBC总数依然采用电阻法

WBC分类方面采用VCS技术

Coulter公司设计在单一通道上同时用这三种方法对同一白细胞进行测量，避免了有些血液分析仪要设计好几个通道或加染色试剂的麻烦。很显然，有些细胞，如嗜中性与嗜酸性细胞，若单用一两种方法（如体积加散射）结果十分相似，其二维散点图上有相当大的重叠。用了VCS技术后，一般在三个方面完全一致的情况是很少见的。加上仪器配备了先进软件，可以像流式细胞仪一样调校、设置门限，可在三维图像上将各细胞较好的分开，达到较准确的分类。减少flag的假阳性和假阴性，减少复检率，并可提示幼稚白细胞、异型淋巴细胞等。 VCS技术在Coulter公司的STKS、MAXM以及Gen.s上均已成功的应用。。此外这类仪器还可直接计数CD4和CD8淋巴细胞，并算出其比率。其原理是：将包被了抗CD4和CD8单克隆抗体的聚苯乙烯微球，加到血中。含有相应表面标志（抗原）的淋巴细胞会结合相应的微球，从而改变了该细胞的VCS性质，即可在STKS等型号后的分析仪上加以测定。

官方资料如下：

库尔特运用VCS 技术对白细胞进行五项分类，运用V、C、S 三种探针，在流式通道的检测点，对通过的单列白细胞进行逐个的、同时的、三重的检测，用三维分析技术直接分类白细胞各亚群。

库尔特白细胞分类用试剂先溶解红细胞，再使白细胞恢复到原态，进入流式通道接受检测。

在流式通道内运用鞘流技术，令其在流式通道内作最适的单细胞排列，逐个、同时地接受VCS 三重检测。

上图是体积测定

VCS 技术运用V、C、S 三种探针，从体积、细胞核特性、颗粒特性等方面综合分析

白细胞，检测细胞的视角与手工镜检相似。

1． 用低频电流准确分析细胞体积，是库尔特专利技术。

体积是区分白细胞亚群一个很重要的参数，它能有效区分淋巴细胞和单核细胞。

上图是高频传导

2．Conductivity-Opacity(传导性-阻光性) 运用高频电磁探针检测细胞核及核质比的特性，是库尔特专利技术。

细胞膜对高频电流具传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份令电流的传导产

生变化，其变化量(RF)可以用来反映细胞内含物的信息。

该参数可用来进一步区别体积差不多的细胞，如：淋巴细胞和嗜碱细胞，由于它们的

细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。

上图是光散射

3.Light Scatter-RLS(激光散射)

运用一个氦氖激光源发出的单色激光扫描细胞，收集细胞在10O～70 O的散射光

(MALS)，提供关于细胞颗粒性的信息。可以很好地区分颗粒特性不同的细胞。

上图是VCS整体技术示意图

4.三维分析

仪器将检测8,192 个白细胞，根据每个细胞的V、C、S 检测量，将它们分布到一个

VCS 三维坐标(分辨率为256×256×256=16,777,216)上，得到白细胞各亚群的分布区，其

分辨率是至今为止最高的。高分辨率不仅令五项分类清晰，还可以提示许多异常细胞区域

的报警。

DIFF分类图1

DIFF分类图2

DIFF分类图3，立体3D图形分析

在三个散射图当中可以清晰的分出5个分群，在STKS和HMX等机型上除了有RET散射图之外，由于增加的T淋巴亚群的标志物，因此可以对某些T淋巴亚群进行分群，从而多出2个或以上的流式离散图。

上图是VCS检测部分示意图

ABBOTT WBC分类技术的实现

ABBOTT 的五分类型号众多，从3000开始，3500，3700，3200，到现在的4000，除3200外，其余都采用RBC/PLT电阻法，WBC总数是两种计数方法比对，即电阻法和激光法（多角度偏振激光散射测定，MAPSS）用两种方法分别进行WBC总数测定，从而准确性极高，3200只用MAPSS一种方法进行WBC/PLT/RBC的总数及WBC分类测定，下面讲述分类的实现：

多角度偏振光散射白细胞分类技术（multi — Angle polatised scatter separation of white cell,MAPSS）其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞嘌粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透透压高于鞘液渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时的红细胞折光指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。

　　在鞘流系统的作用下，样本被集中为一个直径为30μm的小股液流，该液流将稀释细胞单个排列，因是单个通过激光束，故在各个方向都有其散射光。可以从四个角度测定散射光的密度，看图

①0⁰：前角光散射（1⁰～3⁰）粗略地测定细胞大小；②10⁰：狭角光散射（7⁰～11⁰）测细胞结构及其复杂性的相对特征；③90⁰：90⁰消偏振光散射（70⁰`～110⁰），基于颗粒可以将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。④90⁰：垂直光散射（70⁰～110⁰）主要对细胞内部颗粒和细胞成分进行测量。可以从这四个角度同时对单个白细胞进行测量和分析，将白细胞分为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5种。ABBOTT的五分类定量很有意思，不用传统的体积定量，而是采用数量定量，每次计数时完成10000个细胞测定即停止，这一点上比库尔特多1000多个细胞测定。

分类的先后执导顺序是：

(1)0°表示大小;10°表示细胞内里的复杂性，例如:有粒的、多核的、10 °讯号就比较强;90°直角表示分叶情况和90°直角消偏振光用来显示嗜酸性细胞。电脑从90°直角与10°分出多核细胞和少核细胞，又由多核细胞里认出嗜酸性细胞会有较强的90°直角消偏振光，因而与嗜中性细胞分开。 　(2)之后又由0°和10°，利用浮动界标分出淋巴、单核及嗜碱性细胞，而白细胞的数目也由0°找出，故分类及数目的结果是在同一个步骤里完成， 这是跟其也融合多种技术，但不是利用流式细胞仪原理。 (3)这最新的90°直角消偏振光的应用，跟其它用光散射法的仪器不一样。 通常来说，其它只用高或低散射角度，而未有用消偏振光技术。这在临床病例里，例如爱滋病，用这新的方法准确报告嗜酸性细胞。 (4)共它白细胞分类，除了基本的五分类外，多角度激光法也提供了其它4 种分类及数目，指示在病理一些特别的报警，提供化验人员这些资料，以便比较从人手推片得出来的结果。这报告亦提供用户一些可能存在的病理成因。例如: 异常淋巴%及#胚细胞%及#未成熟粒细胞%及#带形核嗜中性细胞%及# 免受干扰的白血球分类 我们知道白血球分类的干扰，包括有核红细胞干扰淋巴或有一些抗溶性红细胞被误为淋巴，影响分类及白细胞数目。最新的激光技术揉合了电阻法的强项，打开了一个新的局面，为技术人员提供可报告的结果，省却很多人手工作修正。为处理抗溶性红细胞干扰，同常用比较强的溶解液或延长样本孵育时间，故揉合了电阻法的激光法分析仪能给予正当结果。因在激光法没有溶血剂， 只用鞘液，保持细胞在原始状态，故单用激光法的仪器只会报警有可异发现。所以，用户可以用另外一个进样模式，就是“延长孵育时间”，进行操作。这结果与电阻法结果配合。 电阻法误认有核红细胞为白细胞，故电阻法的报告会比激光法高，基于这一差异，找出有核红细胞的估计就用公式消除这一影响。

这是0度和10度角的散射图，已经很明显的区分出了五分群的散射图，但是，各个角度的组合散射图再加上RET，MAPSS技术提供的散射图多达7个，同时，还能提供6个直方图。除3200以外的其他机型上如果激光分类部分出现问题无法使用，可以软件调整出三分类使用。

BAYER ADVIA120的计数的实现

RBC和PLT采用了完全不同于传统的电阻法，全部采用激光方法，具体的实现如下：

光一个RBC及其相关的RET散射图就有这么多，令人咂舌。测试之前所有细胞己等量球体化（即充盈技术，特别是血小板充盈，采用这一技术的还有cd4000,xe2100等），故此它们在鞘流池中的方向亦不那样重要

低角度激光光散射量度细胞体积

高角度激光光散射量度折射指数＝血红蛋白浓度

每个细胞都根据以上二种不同的检测方法量度

具体实现请看图

PLT的测定方法也是类似，因为在一个通道里面，得到的散射图如下：

下面是PLT的2D图形

HGB参数前面介绍的仪器都是比色法得出的，而ADVIA120则不同，完全采用MCHC和MCHM计算得出的，直接(CHCM)及间接(MCHC)量度血红蛋白量度的血红蛋白值为一报告值, 科研用屏幕亦会显示计算的血红蛋白值提供两种数值可帮助减低重复比率, 及协助仪器接受高脂血与胆红素高的血液HGB也提供直方图形提示。血红蛋白值计算 = (CHCM x MCV x RBC) / 1000

RET计数原理跟RBC/PLT 相同，不过多了一个水平角度吸光度测定

因此它也得到数个散射图，下面仅仅是个总图

WBC分类技术的实现：

利用过氧化物酶作为WBC分类的试剂

• 利用热力固定白细胞、令红细胞破裂、 将过氧化物酶粒体染色

检测原理如下：

其中分为过氧化酶通道和BASO通道

过氧化酶通道的测试原理是

通过过氧化酶试剂的作用，经过水平角度吸光度测定和5-15度激光散射来取得分类信息，在这个通道里面可以得到下列参数信息：

在BASO通道里面，测试原理如下：

通过试剂作用，经过2-3度角散射光和5-15度角散射光的共同测定，得到下面参数

以上这些技术使得ADVIA120可以测得的参数有：

• 细胞计数参数 （13个）

• 白细胞分类参数 （12个）

• 血小板参数 （6个）

• 网织红细胞参数 （8个）

• 细胞形态参数 （16个）

总共多达55项，还有很多自定义项目没有列入。

具体参数如下：

• WBC 白细胞总数

• RBC 红细胞总数

• HGB 血红蛋白量

• HCT 红细胞压积

• MCV 平均红细胞体积

• MCH 平均血红蛋白量

• MCHC 平均血红蛋白

浓度

• CH 单个红细胞血红蛋白含量

• CHCM单个红细胞内血

红蛋白浓度

• RDW 红细胞体积分布

宽度

• HDW血红蛋白量分布

宽度

• CHDW红细胞血红蛋白 浓度分布宽度

• PLT血小板总数

• NEUT 嗜中性白细胞数量

• NEUT% 嗜中性白细胞百分比

• LYMPH 淋巴细胞数量

• LYMPH% 淋巴细胞百分比

• MONO 单核细胞数量

• MONO% 单核细胞百分比

• EOS 嗜酸性粒细胞数量

• EOS% 嗜酸性粒细胞百分比

• BASO 嗜硷性粒细胞数量

• BASO% 嗜硷性粒细胞百分比

• LUC 大型不染色细胞数量

• LUC% 大型不染色细胞百分比

• PLT 血小板总数

• PDW 血小板体积分布宽度

• MPV 血小板平均体积

• PCT 血小板压积

• MPC 血小板平均浓度

• MPM 血小板平均质量

• Retic% 网织红细胞百分比

• Retic # 网织红细胞数量

• MCVr * 平均网织红细胞体积

• RDWr * 网织红细胞分布宽度

• CHDWr* 网织红细胞血红蛋白分布宽度

• CHr* 单个网织红细胞血红蛋白量

• HDWr * 单个网织红细胞内血红蛋白分布宽度

• CHCMr* 单个网织红细胞内平均血红蛋白浓度

• Left Shift 左偏移

• Atypical Lymph 变异淋巴细胞

• Blasts 原始细胞

• BL-ABN 异常原始细胞

• Imm Gran 未成熟粒细胞

• MPO De 髓过氧化物酶缺乏

• ANISO 红细胞大小不等

• MICRO 小红细胞

• MACRO 大红细胞

• HC VAR 血红蛋白浓度

• HYPER 高血色素性红细胞

• RBC Fragments 红细胞碎片

• RBC Ghosts 影红细胞

• NRBC 有核红细胞

• Platelet Glumps 血小板凝集

• Large Platelets 大血小板

等等

下面简单介绍一下集成管路板，之所以单独介绍ADVIA120的结构，是因为上面几个机型虽然方法不同但是实现结构大同小异，没有什么独特之处，这也包括ADVIA120的光散射原理虽然他的染色方法独特,但是这个继承了TECHNICON优良传统的改进机型从结构上简直就是脱胎换骨，节省了80%的电磁阀和管道，这在五分类技术上简直不可思议。

我在99年第一次见到这个结构的时候，惊愕----只有这两个词，除了这两个词剩下的就是目瞪口呆、张口结舌，我自认为见过大场面，从机械到电子到卫星通讯海陆空见过很多，但是如此结构还是让我惊叹不已，大胆的构想，惊人的杰作。先不管其实用性和成本的高低，但就这个结构就能看出德国人的意识，不是随便哪个国家所能比拟的。

上面就是这些常见的五分类的计数分类的实现原理或者过程，顺便提一句，ADVIA70就是DANMA的EXCELL22的OEM改进型，也是采用多角度激光技术，类似光电的技术，因此不作为主流介绍。

在具体实施这些技术的时候都是采用机械泵和分血阀，虽然形式和结构不尽相同，但是都是大同小异，目的只有一个就是提高速度，因为大型五分类的速度要求最低要达到90TEST/H,因此采用采样针和注射器的方法过于缓慢，但是PENTRA 60采用此项技术，因为其定位是标本量小的用户，因此继续采用。但是不管大型五分类标称的速度有多快，其单独测试一个标本的速度一般也在60秒甚至高于这个数字，因为连续作样本的时候，在计数的同时，下一个的样本的进样工作已经开始了，属于重叠作业。

例如PENTRA120号称120测试每小时，在机械部不出现故障，不堵孔，不报警，不出现试管被卡的情况下，从做第一个标本到第120个标本的报告打印出来时间是70分钟，但是如果计算第一个标本开始被采样到最后一个标本被采样差不多就是60分钟。

[此贴子已经被作者于2005-4-19 14:14:30编辑过]

再加深一步学习

谢谢郑老师的分享

谢谢老师了啊！！

很好的东西！！！

虽然看不懂，不过还是得学习。

非常感谢郑老师，可以让我好好学学了。

积累经验，谢谢。

谢谢老师教学！

地处经济不发达的医院，1月份才有了光电的五分类，郑老师的讲义真的不错，不过我看到我是比别的地方落后好多年啊！唉，还是好好学习把。

非常喜欢

比较实用，感谢分享。

MEK-8222K的直方图应该是这三个吧，main 散点图，NE-EO散点图，MO-LY-BA散点图吧，楼主是不是少了淋巴细胞了，这只是我自己的推测，不知道对不对。

实用，谢谢！

多谢老大 学习了

谢谢楼主

非常感谢，受益匪浅