[转帖]放射免疫分析法原理及操作注意事项

放射免疫分析法原理及操作注意事项

【关键词】  带状疱疹；虹膜炎；放射免疫分析

　　［关键词］ 带状疱疹；虹膜炎；放射免疫分析

　　放射免疫分析的原理［1］：就是利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它又分为两种方法。

　　1　竞争性RIA，又称传统RIA

　　主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag*+已知定量抗体Ab 标记抗原与抗体复合物Ag*Ab+未知抗原与抗体复合物Ag　Ab+游离标记抗原Ag*(去除)(未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关)。临床上甲胎蛋白（AFP)，癌胚抗原（CEA），β2微球蛋白（β2MG )，铁蛋白（Fer），人绒毛膜促性腺激素β亚单位(HCGβ)等的检测都是竞争性RIA法原理。竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，将非标记抗原(被测物与标准品)、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂分离B(复合物)与F(游离物)如：AFP，β2MG，Fer；顺序加样法，先将非标记抗原(被测物与标准品)，与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B与F如：CEA；急诊检测法：为临床急需检测结果而提出的反应方式，不等RIA反应达到动态平衡就终止反应；分离剂的选择有，PEG(聚乙二醇)，第二抗体等。现在一般采用的是：第二抗体与PEG合用的方法，称为双抗体PEG法。PEG原理：PEG浓度达到7%9%时能使抗原抗体复合物沉淀。优点：经济，简便，通用。缺点：重复性差，非特异性结合率高。第二抗体：第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体，来自家兔或豚鼠。用第一抗体为抗原，作用到羊，马身上，产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合，生成分子量很大的免疫复合物(AgAb1×Ab2)，能自然沉淀。优点：分离效果好。非特异性结合率低。缺点：增加经费投入。需要第二次温育，延长了时间。所以就产生了两者合用的双抗体PEG法,它结合了上述两种方法的优点。

2　非竞争性RIA，又称免疫放射分析(IRMA)

　　主要特点：标记的是抗体。按反应原理分为两种：单位点IRMA，其原理：抗原只有一个抗原决定簇,所测的抗原为小分子抗原，*Ab+AgAg* Ab+*Ab+ImAdAg ImAdAg*Ab+Ag*Ab (去除)(负相关)※：(ImAdAg)固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇,所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAdAb+AgImAdAbAg+*AbImAdAbAg*Ab+*Ab(过剩的,游离的)※：(ImAdAb)固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体双位点IRMA，又称双抗体夹心法，从加样测定顺序上看，有三种方法：固相抗体先与未知抗原结合，再与标记抗体结合(正向两步法)。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体抗原标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原先与标记抗体结合，再与固相抗体结合(反向两步法)。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体抗原标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应(一步法，又称同时加样法)。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体抗原标记抗体复合物的放射性计数。这三种方法都生成夹心状的抗体抗原抗体复合物，故又称双抗体夹心法。糖类抗原CA50，CA125就用的是其中的第三种方法(一步法)，血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，生成夹心状的抗体抗原抗体复合物，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体抗原标记抗体复合物的放射性计数。

　　3　RIA法的影响因素

　　pH和离子强度；反应温度，温度一般为37℃，也有45℃，室温，4℃冰箱；反应时间，操作中的注意事项：戴手套、防护镜等，将试剂盒从冰箱中取出，室温下放置30 min方可使用。编号：第二排是被测样品1、2、3、4、5、6……，第一排是标准管：根据标准品浓度由低到高A、B、C、D、E、F、G……。加样要准确，移液器的使用(两个档位，一档吸入，二档排出)吸头(一个标本一个吸头，避免互相污染)。加试剂：先看瓶签，再摇匀，最后吸入。(标记物一般为红色，一抗为兰色)。温育时间要保证：按说明书中所要求的时间温育，可以延长，不能缩短。分离剂加入：混匀静置时间，可以延长，不能缩短。保证抗原抗体复合物与第二抗体的充分结合。温度：注意观察水浴箱的水温，误差不能太大，为±1 ℃，室温25 ℃左右。离心时间：也应按说明书中所要求来操作，转速一般为3500 r/min。往离心机里放反应管时，尽量让它直立(因为倾斜可能会使液体流出)。吸上清液时，沉淀物在试管底部，真空泵的吸头头部不能直接插入到试管底部中央(会吸走沉淀物，而我们的目的是分离保留沉淀物)，应该使吸头贴着试管管壁往下放，并且试管要稍微倾斜，但要在即将插到沉淀物边缘时停止，快速上升取出。少留一点点上清液也可。主要是保证沉淀物完整。进入γ免疫计数器测量时，注意观察做出的曲线好坏：是不是需要修改，剔除坏点。报结果：碰到异常结果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者情况如何，结果是否与患者情况相符，方可报出。非竞争性RIA法中，清洗固相包被珠时，清洗次数要严格按说明书中所要求来操作，不得减少。虽然RIA法的影响因素很多，但操作中只要注意上述事项，RIA法的稳定性还是相当不错的。主要是它存在放射污染，这个问题不易解决，影响了它以后的发展，如今电化学发光免疫分析，化学发光免疫分析，酶联免疫分析，磁酶免疫分析等相继推出，发展很快。RIA法将被淘汰。

参考文献：

　　［1］程绍钧、余裕民，检验核医学［M］.重庆：重庆大学出版社，2003：6275.