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间接法(测抗体) |
双抗体夹心法(测抗原) |
竞争法(测抗原) |
抑制性测定法 |
1 |
包被抗原:用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度(5~20μg/ml)各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2~3小时,贮存冰箱 |
包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1~10μg /ml),每凹孔加0.3ml,4℃过夜,或37℃水浴3小时,贮存冰箱 |
包被特异性抗体:
同左 |
包被抗原:
同左 |
2 |
洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟 |
同左 |
同左 |
同左 |
3 |
加被检标本:每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml,37℃,作用1~2小时 |
每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本,37℃作用1~2小时。 |
分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml,另一组只加酶标记抗原液0.2ml,37℃作用1~2小时。(混合液可作成不同稀释度)。 |
a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml,另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml,37℃作用1~2小时。 |
4 |
洗涤:重复2 |
同左 |
洗涤:同左 |
洗涤 |
5 |
加入酶结合物:每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml。37℃作用1~2小时 |
加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37℃作用1~2小时或由预试实验确定作用时间。 |
—— |
各加入0.2ml抗参考抗体的酶结合物37℃作用1~2小时。 |
6 |
洗涤:重复2 |
同左 |
—— |
洗涤 |
7 |
加入0.2ml底物溶液于每个凹孔,(O.P.D或O.T),室温作用30分钟(另作一空白对照,0.4ml底物加0.1ml终止剂)。 |
同左 |
同左 |
同左 |
8 |
加终止剂:每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。 |
同左 |
同左 |
同左 |
9 |
观察记录结果:目测或用酶标比色计测定(O.P.D用492nm)O.D值。 |
同左 |
用酶标比色计测定a、b两组O.D值,并求出a、b、O.D值的差数。 |
同左 |