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第四节 自动生化分析仪的工作过程和操作方法
一、工作过程
在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。
1．取样加试剂和混匀 样品盘转动，使样品进入待测位置，样品针定量吸取样品加入一反应杯；反应盘旋转；试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置，试剂针定量吸取试剂加入反应杯；搅拌机构将反应杯内液体进行搅拌混匀。此后，便按递进原理对下一样品进行采样、加试剂等同样操作。
2．保温反应和吸光度检测 反应盘旋转，反应杯内液体在恒温条件下进行化学反应，当该反应杯通过吸光度检测窗口时即被检测得到一个吸光度值；再按规定的间隔时间检测反应过程中的吸光度值直至总反应结束。总反应时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间（interval time），则10min得到34个吸光度值，若15s为间隔时间，则得到40个吸光度值。
分析仪能显示或/和打印反应全过程的时间－吸光度曲线，从这条曲线上，能观察和计算化学反应的速度、时间，以及反应呈线性段的时间，从而可为确定分析方法类型、参数设置等提供依据。
3．计算并显示或打印结果 分析仪根据各测光点读数对某一检测项目进行结果计算，并显示或打印出每个项目的报告，也可按标本显示或打印出全部项目的累积。即待某样品指定的项目测试完毕，便显示或打印检测结果。
二、操作方法
（一）操作前的各项检查
1．正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。
2．确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。
3．进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。
（二）校准
分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。
1．校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准，大多数检测项目的校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等，多数生化分析仪已设置有数种曲线方程可将多点校准的结果自动进行数据处理，得到曲线拟和方程，样品的检测吸光度便可通过此方程计算出结果。
2．对校准的要求
（1）选择合适（配套）的校准品，包括校准品数目、类型和浓度。
（2）如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。
（3）确定校准的频度。根据检测项目方法和试剂的稳定性不同而确定不同的校准频度，如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等，至少每六个月进行一次校准。
（4）如有下列情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类，或者批号更换了。如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围，则可以不进行校准。②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检验性能。③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。
（三）质控品测定
质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。
所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序，①设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；②选择质控图的方式，如均值－标准差质控图；③质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表或质控图的形式在屏幕上显示。可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，也可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。
（四）检测项目的输入与测定
1．项目输入
（1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。
（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。
（3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。
2．进行测定 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还有选择：①是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；②测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。
3．急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以及急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。
（五）样品的减量与预稀释方式
当样品中待测物浓度很高时，其结果往往会超过该项目的线性范围上限。此时分析仪一般会进行自动减少样品量重新测定。分析仪在结果计算时会自动按照样品量的减少比例进行计算。样品的预稀释方式是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。操作过程是，首先由样品针吸取一定量样品，加入反应杯，然后反应杯旋转至加试剂位置，由试剂针吸取稀释液加入已取样品的反应杯，由搅拌针进行搅拌混匀，当再次旋转至取样位置时，由取样针在已稀释的反应杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反应杯。前一个反应杯作为预稀释样品用，后一个反应杯将加入试剂产生化学反应用于测定。样品预稀释的优点在于，稀释过程能自动化进行，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。但是每进行一次样品预稀释需占用3个取样周期(sampling cycle)，使分析速度减慢。
（六）分析仪的维护
分析仪的常规维护(maintenanc)是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护，一般包括每天维护、每周维护、不定期维护等几方面。
1．每天维护 ①清洗样品针，试剂针，特别是搅拌棒容易缠上纤维蛋白，是最常见的交叉污染源。②加试剂。③加清洗剂。
2．每周维护 ①执行比色杯清洗程序对比色杯进行清洗。这是由于比色杯经过反复使用后，会在比色杯内壁附有用常规方法难以彻底冲洗的物质，这些物质会引起交叉污染，通过使用专用的反应杯清洗剂能比较彻底地对这些附着物进行清洗。②对比色杯进行空白吸光度检查，以了解比色杯经过一段时间使用后透光性的改变情况，以及光路系统的情况。③对于用恒温水浴方式进行保温反应的仪器，要对恒温水槽进行清洗。
2．不定期维护 是指对一些易磨损的消耗部件进行检查与更换。①检查进样注射器是否漏水，检查各冲洗管路是否畅通，检查各机械运转部分是否工作正常。②比色杯是否需要更换。③光源灯是否需要更换。
（七）分析仪数据连网
分析仪的数据连网是指分析仪与实验室网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成，通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式（形式）更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。
三、自动化分析与手工操作的比较
与手工法相比，自动化分析具有许多优点，但也存在一些缺点。
（一）优点
1．检测速度快。
2．检测灵敏度高 由于分析仪采用了高灵敏的发光二极管等检测器，使可检测的吸光度达1.0-3.0甚至以上，多数在2.5以上，且吸光度可精确到0.0001。因而在符合郎伯－比尔定律的前提下，线性上限提高 。
3．检测准确度高 分析仪能全过程检测吸光度，因而能准确地判断终点；使终点法结果准确，能做连续监测法使酶活性检测更准确，以及各种自动监测判断功能使检测结果的准确性提高。
4．检测精密度高 分析仪尤其是高档分析仪，其取样品和加试剂的精度高，人为误差小，各类偶然误差也小，使检测精密度大大提高。
5．样品和试剂用量减少 样品用量减少的主要好处是在同样采血量的前提下，可检测项目增多；试剂用量减少则大大降低了试剂成本。
6．其他 ①能精确地控制反应时间，这对于连续监测尤其重要。②能精确地控制反应温度，这对酶促反应特别重要。③能进行复杂的结果计算，如非线性计算，使非线性的检测项目如载脂蛋白能得到准确测定。
（二）缺点
1．选择次波长较困难 因分析仪无连续波长可选，因而选择合适的次波长有时很困难。
2．操作时间受限 如各检测项目加试剂时间只能统一固定在2到3个时间点，总反应时间只能固定在10min或15min等。
3．操作复杂性受限 ①加试剂的次数受限制，多数只能加1到2种试剂即单试剂法或双试剂法，因而有些检测方法无法在分析仪上测定，如改良J-G法测定血清胆红素。需加三次或以上试剂的检测项目就无法进行自动化分析。②无法做复杂的操作如检测过程中的离心、过滤、萃取、煮沸等步骤，使有些检测项目无法实现自动分析。③选择和改变反应温度困难。
4．样品量/试剂量的比例受限制 由此影响了某些检测项目的最低检测限和线性上限。
5．做参考方法受限制 由于操作复杂性受限，以及反应过程中发生的现象难以观察，不能中断操作过程做一些灵活的操作改变等，因此操作复杂的参考方法一般由手工操作。
6.仪器维护和保养较复杂。
第五节 干片式生化分析仪简介
一、仪器结构
干片式生化仪由干片(dry sheet)试剂和检测仪器两部分组成。
（一）干片试剂
所有检测项目的试剂都做成干片，成为干片试剂，干片试剂的结构从上到下一般分为展开层、试剂层、显色层和支持层，见图7-10。
（二）检测仪器
检测仪器也有半自动和全自动之分。半自动分析仪在分析过程中试剂片的选择与放入和待测样品的加入均需要由人工逐个去完成，且测定速度较慢。全自动分析仪则只要在样品盘或样品架上放好待测样品，在操作屏幕上设定好需测定的项目，由分析仪自动选取干片试剂、自动进行定量取样、孵育和检测，且测定速度较快。
二、分析原理
（一）分析过程
样品在干片试剂中各层中的反应过程如下。
1．展开层 待测样品定量加到干片试剂上，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。
2．试剂层 样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。
3．显色层 化学反应的产物在显色层与显色试剂起呈色反应。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。
4．吸光度检测 整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一部分光线被吸收，另一部分光线则反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。（图7-10）
图7-10 干式试剂测定示意图
（二）分析方法原理
测定不同待测物利用不同的方法原理。如血氨测定，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝（bromphenol blue）,其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反应产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反应时间5min，波长605nm。
第六节 自动生化分析仪性能评价
生化分析仪有全自动和半自动之分。全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的项目代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。某些全自动生化分析仪不具备清洗反应杯的功能，必须将反应盘从分析仪中取出手工清洗，高档自动生化分析仪则能自动清洗反应杯，因而节省了时间，提高了效率。自动化程度越高，人力资源越节省，高档自动化仪器节约了大量的劳动力。举例来说，一台分析速度为1600测试/h的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要15到20个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。
半自动分析仪的工作原理为连续流动式分析，实际上叫自动比色仪可能更恰当，其流动式管道即为比色杯，因而不同样品反应液之间互染率大。其优点是结构简单，价格便宜，无不同比色杯之间的吸光性差异。缺点有：① 交叉污染较重，样品间、试剂间以及反应液之间相互影响不可避免。②每个样品检测后均需冲洗才能进行下一个测定，速度很慢。③分析过程中的某些步骤需手工完成（如加试剂、取样、混合、保温等）。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于研究性实验或教学中。
分析速度是自动生化分析仪最重要的分析性能，其次，与分析方法性能类似，生化分析仪的分析性能也包括准确度、精密度、检测范围等。
一、分析速度
在分析方法相同的情况下不同分析仪的分析速度不同，影响分析速度的有以下因素：
1．通道数量 通道(channel)数主要与分析仪所能容纳的试剂瓶数量有关，因为试剂瓶数量决定分析仪同时能测定的项目数。半自动分析仪为连续流动式，属单通道分析仪，一次只能分析一个项目，要等一个样品或一批样品相同的项目测定完毕后才能分析另一个项目，因此分析效率很低。多通道分析仪可同时任选多种测定项目检测，因此分析效率高。
2．取样周期 每加一次样品或试剂的时间为一个取样周期，取样周期决定了分析仪的工作速度。加试剂周期与取样周期相应；对于单针取样的分析仪，如取样周期为10s，理论上每60min可取样360次，则其工作速度为360测试/h；若取样周期为4.5s，则理论工作速度为800测试/h，依此类推。只有一组加试剂装置的分析仪在做双试剂法测定时，加第二试剂也要占用一个取样周期，使工作速度减半；如果有两组加试剂装置，因在另一试剂吸取位置添加第二试剂，所以工作速度不变。
3．反应杯数量 反应杯数量多，容许同时处于取样、反应检测和清洗状态的反应杯数量便多，分析效率可提高。反应杯数量多可为较短的取样周期提供条件。
4．一次能容纳的样品数量 一次同时能容纳的样品量也即批处理样品量，分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程，这两个过程各需要数分钟到十数分钟不等。因此，若批处理样品量大，则分析速度快。
5．试剂瓶容量 试剂瓶容量小，对检测频率高的项目（如葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶等），可能会出现在某批样品测定中试剂不够的情况，此时需中断测定添加试剂，而使检测效率下降。正因为如此，对这类高频率出现的检测项目，有时设置两个试剂瓶位置。
6．合适的项目组合 具双圈反应盘（一般有240×2个反应杯）的分析仪有两套阵列式光电检测器，能同时对内圈和外圈的反应杯进行吸光度检测。这种系统要求有两支取样针，1个样品被两支取样针同时吸取两份样品，分别加于内外圈反应杯中，其加试剂装置为灌注式，可同时在两个反应杯中加两种不同的试剂。这个系统的测试速度更快，如果取样周期为4.5s，理论上每小时可得到1600个测试。这个系统还可配置4支取样针，1个样品被4支样品针同时吸取4份样品，放到双圈反应盘的4个反应杯中，然后同时加4种不同的试剂。这时如果取样周期为6s，则理论上每小时可得到2400个测试。
在双圈反应杯、2支取样针或4支取样针系统，一次能同时对一个样品的2个或4个检测项目吸取样品，这2个或4个检测项目便需组合在一起测定。也就是说，如果一个样品同时需要检测该2个或4个项目，则能使分析仪发挥最大的分析效率；若某一样品只需要检测该组合项目中的1项或1-3项，则该分析仪的分析效率便不能最大程度地发挥。
7．组合式自动生化分析仪 其分析速度为各分析模块分析速度的加和。如两台每小时分别为2400、800个测试的分析模块，可组合成理论上最大分析速度为每小时3200个测试的分析仪；两台同样为每小时1600个测试的分析模块，也能组合成理论上分析速度为每小时3200个测试的分析仪。
二、分析仪性能指标
自动生化分析仪的性能除分析速度外，还包括准确度、精密度、检测能力和检测成本等。分析仪生产厂家关于其分析仪的介绍资料中通常列出许多性能指标，这些指标实际上是性能的解释。
（一）准确度
吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。
（二）精密度
以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。
（三）检测能力
1．检测方法 多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。
2．检测时间 分析仪通常可检测最长10min的反应，个别能检测15-22min甚至更长时间。3．加试剂次数 能加1-4种试剂，多数为2种。
4．检测范围 对微弱光线的检测能力即能检测吸光度的最高值，其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。
（四）检测成本
反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量。
三、常用自动生化分析仪性能介绍
目前国内使用最多的全自动生化分析仪有日本系列、奥林巴斯系列、雅培系列和贝克曼系列和德灵系列等，有关的性能指标见表7-3。
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