我国临床检验50年进展[转帖]

我国临床检验50年进展 丛玉隆　陈宝梁　孙芾　彭明婷 　　随着基础医学的飞速发展，先进科学技术和实验仪器的广泛应用，检验医学在临床诊治疾病工作中发挥了越来越重要的作用。在我国，由于改革开放的深化，经济实力增强，与国外技术交流和信息沟通加快，以及新仪器的大量引进，加速了医学检验前进的步伐，缩短了与发达国家的差距，其中近10年来"临床检验"的进步之大尤其令人瞩目。 　　所谓"临床检验"（临检）是在我国特定社会和历史条件下形成和遗留下来的一个不十分恰当的名称。其原意是指除了临床化学、微生物学和免疫学以外的检验项目，这些检验项目在历史上开展最早，涉及专业面广泛，以往大部分只需要用物理、化学试验和显微镜检查即可完成，此类工作定为"临床检验"本身就十分不妥。因为医院内所有的检验都是服务于临床的，都属于临床检验。尤其是当今科学发展趋势是各学科的相互融合和渗透，高科技术深入普及与应用，使"临检"这个"古老"学科发生了深刻的变化，并深化演变成各个专科检验技术（如血液学检验技术、体液学检验技术、寄生虫学检验技术）而取代"临床检验"这一传统的概念。作者将介绍50年来，我国在此领域的进展。 　　一、血液分析进展 　　传统的血液分析检查，完全用手工方法，包括将血液稀释用显微镜计数红、白细胞，沙利氏酸化血红蛋白法测定，血红蛋白及手工推片、染色、显微镜目测法做细胞分类，50年代库尔特先生利用电阻抗原理，设计了血细胞计数仪，使细胞的计数精密度提高3～5倍，避免了繁重的目力计数。同时50年代也生产了血红蛋白仪，利用碱化血红蛋白原理及30 g/L、180 g/L双标准校正仪器,同样可使测定速度及精密度提高数倍。北京医院于1959年引进瑞典生产的血细胞计数仪及血红蛋白仪，均系我国首次使用血液测定的仪器，并很快地总结了使用经验，由叶应妩教授在东北三省学术会上作了交流。 　　上海的工程师张根福通过对进口仪器的剖析，参考国外文献与国内科研单位协作，于1961年生产出国内第一台血细胞计数仪，随后南京无线电原件总厂、济南三联电子仪器厂、北京生化仪器厂先后生产了各种型号血细胞分析仪。 　　70年代由于计算机技术的快速发展，血液分析仪进展也很快，但早期开发的血小板计数仪不能将血小板与红细胞清晰分开，故必须用富血小板血浆进行测定，虽可测定血小板，但手续非常繁琐，此后由于检测技术进一步提高，检测范围从2fl至400fl可一起测定，加之浮动界标技术的应用，故可用全血进行血小板测定。 　　80年代血液分析进展迅速，在八项分析仪的基础上，红细胞体积分布宽度(RDW)及血小板平均体积(MPV)、血小板压积(PCT)、血小板体积分布宽度(PDW)均可进行测定，并且可将血小板、红细胞、白细胞的分布直方图打印出来，不仅可提供是否贫血的信息，而且可进一步对贫血的类型及原因提供有用的信息。血小板各项参数对止血与血栓疾病的诊断及一些疾病的疗效观察均有重要参考价值。在此期间陈宝梁等发表了"血小板计数及平均体积的参考值"、解放军总医院临检科对RDW在贫血的诊断、鉴别诊断及药物疗效观察方面的临床价值进行了系列研究。进入90年代，随着全自动仪器的广泛应用，应用静脉血取代末梢血进行血常规检查逐步在全国普及。北京市协作组7单位发表了"北京市2 013名正常人静脉血各种细胞成分参考值调查结果"，对仪器检测在临床上的应用及质量控制起到了推动作用。 　　白细胞分类的开发：初期是按细胞大小分成不同的群体，有分为2群的，大细胞相当于粒细胞，小细胞相当于淋巴细胞。有分为3群的，大细胞相当于中性粒细胞，小细胞相当于淋巴细胞，嗜酸、嗜碱及单核细胞均相当于中间型细胞。现在国内大多数实验室所用的血液分析仪均为二部或三部分类，此种仪器的所谓分类，只能起到过筛作用，当白细胞数过高、过低、白细胞直方图异常及其他信号时，则应做涂片染色显微镜检查。 　　由于激光、射频及化学染色技术的应用，一些高档仪器已可做白细胞的五部分类，如光电公司的激光法Celltacs 8108K型，亚培公司的CD-3000、CD-3500采用电阻抗与激光结合，库尔特公司的MAXA、STKS采用电阻抗、射频及激光技术，东亚公司的NE系列采用电阻抗及射频技术，SE-9000加用硫化氨基酸可检测幼粒细胞，拜尔公司的Technicon H系列采用化学反应与激光技术结合原理进行五部分类测定。 　　全自动血液分析仪的生产，从标本混匀、吸样、稀释、分配、测定及打印结果，全部自动完成，不仅节省人力、减少繁琐劳动，且由于避免了手工吸样，大大增加了测定结果的精密度。 　　由于改革开放，吸收国外先进经验，此期间大量引进了血液分析仪，多种型号（包括上述各型五分类）的仪器大量为各医院所采用，使我国的血液学分析有了很大的跨越。 　　90年代设计生产了专用的网织红细胞（网红）计数仪。80年代Tanke等就用流式细胞仪(FCM)进行网红计数，由于计数细胞量较手工法大大增多，因此其精密度大大提高。由于流式细胞仪在常规实验室中使用很少，所以库尔特公司、拜尔公司等设计了可进行网红计数的血液分析仪，非常方便临床应用。日本东亚公司设计生产专用网织红细胞计数的流式细胞仪，它不需要固定细胞，细胞与荧光素结合后即可进行测定，非常便于自动化测定。东亚公司R-2000、R-3000网织红细胞仪与拜尔公司Technicon H3还可根据网织红细胞的荧光强度，将其分成低荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)及高荧光强度网织红细胞(HFR)三部分，幼稚网织红细胞显示强的荧光，随着网织红细胞成熟，其荧光逐渐减弱。 　　仪器法测定网织红细胞计数细胞量大增，使得精密度大大提高，对网织红细胞作为贫血治疗的监测指标其意义及可信程度大为提高。HFR和HFR+MFR作为骨髓移植、化疗、放疗的监测指标，其出现或增高均早于白细胞、粒细胞、血小板等常规监测指标，且不受感染、排异等影响。卫生部临床检验中心和解放军总医院分别使用R-3000网织红细胞分析仪和Technicon H3多功能血细胞分析仪，2种原理截然不同的分析仪器，进行了国内上述3种参数的正常参考值调查。结果显示：尽管调查群体和使用仪器不同，但正常参考范围极相近，分别为1.6％，11.8％，86.5％和2.6％，11.3％，86.1％。有作者对5例骨髓移植病人及18例肿瘤病人化疗前后各项血液细胞指标进行了观察，显示网织红细胞数特别是HFR有重要的临床价值。 　　90年代生产了血液学全自动系统。近年生产了自动涂片制备及染色的仪器，免除了涂片及染色中的手工操作，每小时可制备涂片120张，且可根据血液分析仪检测的红细胞压积，自动调整涂片血量、推片速度及角度，可得最佳的血涂片。 　　现代的全自动系统可将高档的全自动血液分析仪、网织红细胞分析仪及自动涂片染色系统组合在一起，再加上条型码及条码认读器，则可方便实验室的分析功能及流水作业完全自动化。下达指令后，仪器即可按照指令进行操作，且将有用的信息，如各标本现时的状况以及制备的涂片均可呈现于屏幕上，如需要即可打印出来。同济医科大学同济医院已使用血液学全自动系统。随着我国经济、科学的不断发展，我国血液分析技术一定取得更大的发展。 　　二、止血与血栓实验诊断进入新阶段 　　在50、60年代，在检验科出血性疾病检查多仅限于血小板计数、出血时间、凝血时间、血块收缩试验，进入70年代，血小板粘附、血小板聚集等功能实验逐步进入常规诊断，只有在少数教学医院，进行手工法较为粗糙的凝血因子筛选试验，如白陶土部分凝血活酶时间测定(KPTT)、凝血酶原时间测定(PT)等等。80年代后期，随着生物化学、免疫和分子生物学技术的不断深入，出血性疾病试验发展成为血栓与止血这一门边缘学科并得到迅速发展，检测血栓与止血的实验方法已应用于临床诊断和相关的研究。近5年来，血栓与止血试验作为一门独立的诊断学科，无论从实验方法和临床应用都发生了根本的变化。血浆纤维蛋白酶原A肽、B肽检测的方法学建立、各种方法对D-二聚体的检测试剂盒的研制和应用、血清内皮素与一氧化氮在止血过程变化的研究，血小板α颗粒膜蛋白(GMP-140)、抗酶凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、蛋白C检测(PC)、蛋白S检测(PS)、组织纤溶酶原激活物检测(tPA)、组织纤溶激活物抑副物检测(PAI)等各项参数联合应用进行血栓性疾病的动态观察等已成为检验医学中医、教、研不可缺少的一部分。 　　方法学的研究为临床治疗提供了重要的实验依据。王淑娟等围绕血液流变、血小板及凝血因子等方面进行了许多基础理论的研究和临床抗凝药物的观察，并建立了简便快速的适合于检验科诊断的纤维蛋白原A肽(FPA)、tPA活性和纤溶酶原测定(PLG)含量的实验方法。广州医学院为了保证肝素的疗效及降低出血的危险性，用试管法和仪器法研究了凝血酶凝固时间(TT)与血浆肝素含量之间的关系，发现在一定浓度的凝血酶作用下血浆肝素含量在相应范围内与TT的对数呈良好的线性关系，建立了同时测定患者原血浆与对倍稀释血浆肝素含量的方法，扩大了检测范围，最高达血浆肝素含量6 400 U/L，且能用于纤维蛋白原或抗凝酶－Ⅳ严重减少时肝素含量检测，该方法适用于多种肝素制剂。使用此种方法对接受肝素治疗的患者进行了血药浓度的观察，发现按公斤体重计算血中肝素含量的差异较大，疗效难以掌握，应实行计量个体化给药原则。大剂量给药（如体外循环）需用鱼精蛋白中和实验时，该方法较传统的肝素中和实验（鱼精蛋白法）更为准确。 　　活化蛋白C抵抗物(APCR)的研究与临床应用，使我国血栓与止血实验诊断工作进入新阶段。APCR是近年发现的最常见的家族性易栓症的病理因素。其首先被瑞典科学家Dalhback发现，1994年，荷兰Leiden大学教授在APCR患者发现凝血Ⅴ因子基因1691位上的突变，从而导致Ⅴ因子的活化蛋白C(APC)裂解位点Arg506→Gln。突变的Ⅴa保持着原来的促凝活性，但被APC降解大大降低了，导致高凝状态的产生。研究证实APCR可使患者终生伴有高的血栓危险，杂合子可使血栓危险增加5～10倍，纯合子可增加50～100倍。因此APCR是迄今人们发现的血栓最高危因素。文献报道在正常群体中APCR的发生率：在瑞典是7％～10％，荷兰人3％～5％，美国和巴西分别为6％和2％。近年我国在北京、上海、广东等5省市先后作了这方面的调查研究，其中北京地区正常群体发生率是4％，上海地区为5％。对静脉血栓、心肌梗塞患者检测中APCR发生率明显高于正常，但使人感兴趣的是在上海的APCR中经分子生物学研究未发现1例有Leiden突变，上海瑞金医院李莉等对64例患者、39名健康人用聚合酶链式-限制性片段长度多态性技术做FV Leiden检测，结果在所有患者及健康人中均未发现FV突变，显示FVLeiden突变可能不是引起中国人脑血栓形成的主要原因。显示中国人APCR现象很可能与Leiden突变以外的因素有关。 　　止血与血栓实验质控虽然在我国刚刚起步，却得到令人瞩目的成果。有作者对分析前质量控制进行了系统的研究，探讨了各种因子［包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、AT-Ⅲ、蛋白C、蛋白S、血浆素原、纤维蛋白(原)降解产物及D二聚体］在不同条件下的稳定性。凝血Ⅻ因子最为稳定，在32℃条件下保存24小时，因子活性无任何变化，因子Ⅷ最不稳定，在32℃保存24小时，因子活性丧失95％（仅为原活性的5％）即使放在4℃冰箱保存，24小时后，因子活性也可丧失70％。蛋白C也有相似的变化，在-20℃、4℃、20℃、32℃不同条件下保存24小时，其活性分别丧失13％、20％、44％和58％。而纤溶酶原则随保存温度的增高和时间延长纤溶活性增加，在32℃保存2小时、6小时、24小时，活性分别为94％、101％和105％，而4℃条件保存为78％、89％和92％，这种现象也导致了D二聚体检查假阳性的出现。这些资料对于质量控制方法的建立提供了重要的依据。 　　三、流式细胞术在我国的发展和临床应用 　　流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从以前的基础研究阶段用于临床医学的科学研究及疾病诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪，到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台了。 　　流式细胞术是采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速地分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光情况，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，并对所需要细胞进行分选等功能。随着该仪器性能的不断完善，操作简便的各新型流式细胞仪相继问世，新的荧光试剂不断发现使实验费用日益降低，流式细胞术也从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。 　　早在90年代，孙芾等人就用流式细胞仪检测血内网织红细胞并进行了方法学评价，彭明婷应用流式网织红细胞分析仪对肿瘤病人在化疗过程中的网织红细胞计数与分类进行了动态观察，结果显示化疗后骨髓明显受抑，造血功能开始恢复时中荧光网织红细胞(MFR)的出现或升高较白细胞达到2.0×109/L早6.5天，较网织红细胞绝对值达到正常范围早14天，证明MFR&127;可作为评价肿瘤病人化疗过程中骨髓造血功能开始恢复的敏感指标。朱立华等用细胞分化抗原CD45辅助设门进行300例各型白血病进行分型，证实CD45辅助设门提高了白血病分型的准确性，特别对白血病残余病变、缓解与复发的监测提供了一个可靠的方法学手段。流式细胞仪在止血与血栓的诊断中也逐步深入使用。王建中等先后用FCM对巨大血小板综合征和血小板无力症进行诊断。丛玉隆等分别用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对群体血小板和单个血小板进行了激活前后钙流及钙离子浓度变化的分析，使国内血栓与止血的研究提高到新的阶段。近年来，流式细胞仪深入到常规的体液学检测，马俊龙等应用尿流式细胞仪分析尿中红细胞形态变化可鉴别血尿的来源。李云莲将其用于胸腹水、脑脊液细胞的分析均取得满意的结果。FCM还可用于药物疗效的观察，郑国强等探讨了FCM在肿瘤耐药细胞系(S-180R与BGC-823100X)阿霉素耐药性检测中的应用价值，证明FCM可以直观地检测阿霉素耐药细胞，具有灵敏准确、定量的特点，是肿瘤耐药性灵敏的、功能性的检测方法，以上例子充分说明了近年来FCM的应用已逐步从研究室走向临床检验科室，对我国检验医学的提高起到了重要作用。 　　四、全国临检室间质量评价进展 　　全国临检室间质评活动始于1989年，最初阶段开展的质评项目仅有血红蛋白测定和白细胞计数两个项目，参加质评的实验室也仅有60家，到1999年为止，全国临检质评活动已开展了10年。在这10年中，卫生部临床检验中心增加了质评活动开展的项目、扩大了质评参加实验室的规模、改进或完善了质评方案，同时做了较多的质评研究工作，各个项目的质评成绩也有了改善或明显提高。全国临检室间质评工作取得的成绩： 　　1.质评开展的项目逐年增加：临检质评开展的项目由1989年的2项增加到23项。目前开展的项目包括：全国医院检验科或血液科参加的全血细胞计数(8项)、血细胞形态学(1项)、凝血试验［凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间测定(APTT)和纤维蛋白原测定(FIB)3项］、尿液化学分析（尿试纸条检测10项）的室间质评以及血站参加的血红蛋白测定(1项)室间质评。近4年来，每年都增设了新的质评项目。 　　2.参加质评实验室的规模不断扩大：参加质评实验室的数量由1989年的60家增加到1206家。1995年参加质评的实验室有289家，近4年来参加实验室的数量平均每年以200家以上的速度在递增。 　　3.血细胞计数项目质评参加实验室的总体变异系数(CV)明显下降：血红蛋白测定项目的总体CV由0.092下降至0.030左右，白细胞计数的总体CV由0.208降至0.100左右，血小板计数的总体CV由0.308降至0.150左右，网织红细胞计数的总体CV由0.685将至0.300左右。 　　4.质评参加实验室测定结果的及格率明显提高：血红蛋白测定的及格率由82.4％上升至92％左右，白细胞计数项目的及格率由63.1％上升至85％左右，血小板计数的及格率由76.6％上升到91％左右，网织红细胞计数的及格率由54.8％升至88％左右。 　　5.参加质评的实验室已开展了部分项目的室内质控：目前参加血细胞计数室间质评的实验室都已开展了血红蛋白测定、白细胞计数和血小板计数的室内质控，一些实验室同时还开展了凝血试验的室内质控。 　　6.质评工作中发现的主要问题：仪器与试剂不配套的问题较突出，具体表现在一些国产试剂或试纸条的质量欠佳，无法取代仪器生产厂家推荐使用的配套试剂。一些实验室从未校准过血液分析仪或校准方法不正确。此外，由于受到质控物成本高，国产质控物质量未完全过关的客观条件限制，一些实验室还未开展室内质控。再有就是在质评活动中核对数据和"开小灶"测定质评物的现象仍然存在。 　　五、临床检验一般检查的标准化水平有明显提高 　　为了提高临检专业一般性检查标准化和质量控制水平，1994年以来中华医学会检验学会先后召开了3次专家研究会，并在武夷山会议上对血液学自动化分析，尿液常规检查和止血与血栓一般性筛查实验提出了规范化、标准化试行文件。中华医学检验杂志和中华医学会主办的信息导报都作了具体的介绍。文件的核心内容有以下几个方面： 　　1.有关血细胞分析仪的使用：(1)专家一致认为，为了血细胞分析仪的合理使用（特别是全自动血液分析仪）保证实验结果的准确性，原则上标本应使用静脉抗凝血。(2)杜绝目前有些医院使用血细胞分析仪进行白细胞分类时，只使用仪器分类计数而废弃显微镜涂片的错误倾向，提出只有在白细胞总数，血红蛋白含量，血小板计数均在正常范围之内，细胞体积直方图正常，无报警的情况下，仪器分类结果才可作为筛选数据报告。 　　2.文件中对尿常规检查的内容（物理、化学、显微镜检查）做了明确规定，对于化学尿液检查进行了方法学评价，提出了尿沉渣显微镜检查的规范性操作，并建议逐步在国内以μl代替"高倍视野"为单位的报告方式，文件特别提出对当前某些单位只进行干化学法检查而不注意沉渣镜检的错误倾向必须纠正，并提出无仪器和试纸条质量均合格时，(1)尿红细胞、白细胞、蛋白、亚硝酸盐均为干化学阴性的非肾病、泌尿科病人。(2)无需特殊要求（查管型、结晶）镜检的患者，才可使用干化学法进行尿液中白细胞、红细胞的筛查。 　　近年来，卫生部临床检验中心及各省市医学会、临床检验中心纷纷举办学习班，落实"武夷山精神"，方法学标准化及血液、尿液自动化仪器正确使用有了明显变化，大大提高诊断水平和学术水平，此方面的文章屡见不鲜。北京市血液分析仪应用协作组组织了7家大医院，分别使用6种不同型号的全自动血液分析仪对2 013名正常人静脉血的9项参数进行调查，得出了血液分析仪方法检测正常人静脉血的正常参考值，发现在白细胞计数、血红蛋白含量、MCV、MCH等项指标中与国内介绍的手工法参考值有一定的差异。 　　尿液干化学及显微镜尿沉渣检查的标准化也得到了人们的重视，有人对6 439份尿液的干化学尿红细胞、白细胞检查与沉渣进行了对比分析，评价了干化学的特异性、敏感性及影响试验的因素，提出了筛选条件。中日友好医院用定量尿沉渣板对120份随机健康人的尿液进行镜检定量分析。重庆医科大学检验系，解放军第三军医大学检验系先后介绍了尿沉渣倒置显微镜检查方法，认为利用酶标板和倒置显微镜检查尿沉渣，对尿液中有形成份检出率高、重复性好、易于操作、省时，尤其适用于住院病人每天大批标本的常规检查。同时对比了此法与混匀一滴尿法，离心沉渣镜检法正常参考值并进行方法学评价。 　　随着这方面工作的逐步深入，检验医学试验的标准化、规范化、现代化，其在临床诊断中将发挥越来越重要的作用。 作者单位：丛玉隆　100853 北京，解放军总医院临床检验科 　　　　　陈宝梁　彭明婷　卫生部临床检验中心 　　　　　孙　芾　和睦家医院临床检验科