[转帖]更好更快：提高快速床旁检测

 

Richard L. Egan博士是Nanogen公司（圣地亚哥）免疫检测开发部门的执行理事

第三代侧向流动型床旁检测（POC）平台是对已建立的POC检测系统的再次设计研发。

今天大多数的侧向流动检测都是依赖的小孔色谱分析媒介来帮助液体型样本通过一个狭窄的三维空间，如硝化纤维膜。孔位型结合位点被置于分析物和检测试剂结合成的胞膜中。 这样的结合位点可以具有特异性（例如，考虑中的分析物的特异性抗体）或一般性（例如，类似链霉亲和素的捕捉试剂，其中试剂中的捕捉抗体粘附有一个生物素分子）。因为抗生物素蛋白与生物素之间有很高的亲和性，所以当试剂混合物通过结合位点时捕捉抗体会与抗生物素蛋白结合。

一般性捕捉系统的使用会给侧向流动检测带来某些设计上的优势，包括很多情况下检测敏感性的提高。类似的检测所需要的驱动力或技术支持是由试剂流过硝化纤维膜时产生的。该流动将分析物带到捕捉位点，并且提高检测敏感性，因为三维硝化纤维大的表面积降低了试剂向结合位点移动的需要。建立在这样的设计理念上，Nanogen公司（圣地亚哥）已研发了一种具有较高敏感性且整体性能都提高的侧向流动检测。

设计侧向流动检测的最初意图是提供一种快速、简单易用的检测，使得检测结果可视化。为了增加他们的简易性，让活跃检测组件或试剂在产品的样本流通道内干燥。典型的设计是将单克隆抗体（MAb）或多克隆抗体（PAb）直接应用到硝化纤维膜上来捕捉分析物。MAb或PAb的检测对金属微观粒子来说是必要的，并要在样本流通道内进行干燥。

当将液体样品应用到该设备中时，检测物质要进行再水化，即液体样品在到达硝化纤维检测试纸条之前要先通过试剂或缀合物衬垫。如果检测物质存在的话，试验检测的试剂会在试纸条的测试线上出现一定的颜色。其中颜色形成的原因是金或其他金属颗粒堆积的结果，而这些颗粒在硝化纤维白色背景下是可以用肉眼观察到的。

该简单的检测设计中，反应动力学是由吸水过程和硝化纤维的孔隙度控制的，室温下会在5-20分钟内获得结果。不过，大多数侧向流动检测的敏感度已被限制在ng/ml或以上的范围内。其复现性也比较差（对于变异系数来说，最初的设计经常大于25%，而新的检测设计大约是10%），因此大多数侧向流动检测的应用被限制在需要适度敏感性和定性结果的小范围分析物中。已开发出的较新的检测因复现性提高而展现出较高的定量特性。

侧向流动检测的其他见解
当前的侧向流动检测通常都需要终端用户具备一些专业技术，而需要类似专业技术的原因是操作人员不仅要准备检测样本（如分析前步骤）还要读取可视结果并人工记录检测结果的要求。许多床旁检测（POC）都将会从分析前步骤改善中获得益处，尤其是那些使用棉签作为样本的检测。这样的棉签型检测会从更简单、完全整合化的样本处理系统中获得益处，因该处理系统能避免操作人员对样本的污染，且整个检测系统达到完美结果。简而言之，分析前复杂的步骤将会从使用者身上转移到检测系统上，由此重要的步骤将实现无人操作。

研究和市场部门（都柏林）的市场报告指出：准确度较差的索赔仍是采用POC所面临的重要挑战中的一个。例如，据统计大约88%的心脏参数检测仍是在中央实验室进行的，因为中央实验室具有较高的准确度。POC检测的质量必须提高到能参与竞争的水平。此外，有研究指出因仪器不可连接，操作人员必须手动将数据输入到医院的信息系统中，增加了工作压力和数据记录中出现失误的可能性。目前，仅有15%的POC检测是电子化采集并自动传送到当地信息系统中的。因目前侧向流动检测的不准确性和其他的限制条件，重要的POC检测还未在大多数医疗中心运行。

虽然Nanogen的Nexus Dx系统也是建立在得到确认的硝化纤维侧向流动形式上，但其在其他很多方面与目前的POC检测是存在差异的。系统研发过程中，分析了目前商业检测的一些重要设计元素，包括准备检测样本的分析前步骤。分析结果显示侧向流动的基本原理（如检测物质移动或流动通过硝化纤维或类似物质的多孔性基质）在提高未来检测性能方面有很好的潜能。样本和检测试剂的共同流动降低了扩散影响，同时使试纸条上的检测物质与结合位点有更紧密的接触。

Nanogen还发现流通道内检测试剂的干燥行为在很大程度上导致复现性较差。这一普遍的设计特点致使进入试剂带的液体前面部分有很高的试剂：样本比例，而样本后面部分的试剂：样本比例较低。结果是每次检测中流动动力学只要有任何轻微的变化都会导致信号强度发生重大改变，且大多数侧向流动检测都会观察到较差的检测性能。

改善POC检测技术
为了强调侧向流动检测中的这类问题，Nanogen已在Nexus Dx系统中应用了四个重要的设计元素，从而提高了检测性能。首先，通过采用单位剂量的冻干试剂球将检测试剂从流通道内分离开，其中冻干的试剂球在室温和高温中保持稳定，且与液体样本接触时会立即重新水化。第二，使用高度荧光化微型颗粒，结果是敏感性比目前检测常用的颗粒更高（2-3倍）。

第三，使用了带有Watson和Crick结合化学的双链合成低核苷酸聚合物试剂（pRNA），因此能合成多重独特结合双链。每个pRNA分子都是一个短的低核苷酸，能在室温高度保真下与非互补低核苷酸间无耦合的补体结合。这样，互补链的成分粘附在硝化纤维膜上，而补体聚合或结合到一个捕捉体MAb上。当反应混合物流过硝化纤维膜和流向pRNA补体结合位点时，pRNA/MAb缀合物经常会粘附到pRNA补体上。

为完成检测，如果相关的分析物存在于样本中，它会被通过pRNA捕捉系统依附在硝化纤维膜上的捕捉体MAb和依附在荧光性微珠上的检测MAb束缚。通过这一过程，荧光性微珠积聚在特异性捕捉体或检测线上。同样的过程会同时在检测中用到的但在硝化纤维膜不同结合位点的每一个试剂上发生（见图1和图2）。

图1 该检测是由硝化纤维膜测试纸条组成的，并将特异性pRNA结合序列应用到个体检测线中。在均匀反应混合液中将该检测试剂与样本混合，从而使捕获MAb结合到特异性pRNA上，同时检测MAb与荧光性微珠结合。之后与样本中存在的荧光性抗原反应。

图2 恰当分析物存在的情况下，特异性检测线上互补pRNAs的脱落致使这些检测线上出现铕微珠的积聚。

第四个因素是使用一个简单的荧光性阅读器。该阅读器对检测盒和条形码信息进行扫描。该步骤是在检测试纸条扫描之后进行的，且阅读器记录下每次检测和质控线的信号。计算完检测结果后，阅读器会自动打印出检测结果并在用户界面屏幕上显示出来。该阅读器能将检测结果下载到实验室信息系统（LIS）中。

检测中Europium标签的一个重要的优势是激发和发射光谱被一个宽的Stokes位移分开。这一点使我们能够应用便宜的荧光性阅读器，而这种阅读器需要一种低价格的激发能UV LED和一个光电二极管来从试纸条上记录荧光信号。其中这两个部件都被安装在光学装置中，简化了阅读器的最终装配（见图3）。该阅读器还含有其他对操作者有益的特征，包括允许转换语言的SD卡槽和更新定量检测批号信息的性能。

图3 阅读器用于处理多种类型的Nexus Dx检测，包括Nanogen或其他合作伙伴开发的检测。

Nanogen还努力充分将棉签型样本分析前步骤集合到样本试剂装配中。样本装配设计合并了棉签样本的萃取，这样能同时水化冻干的试剂并将试剂和样本混合在一起得到均匀反应混合物。5-10秒的混合步骤简单、易于传达结果，并且能耐受大范围的时间和动作。样品试剂检测中试剂的混合启动了该检测过程（如，相同反应体积内抗原/抗体复合物的形成应在样本添加到硝化纤维条之前）。

该反应混合物被转移到指示样本/试剂混合物流向硝化纤维膜试纸条的检测盒内。为了进一步提高性能，在检测盒内增加了一种洗涤缓冲数据包来帮助确保全部样本/试剂混合物流向并通过硝化纤维条。数据包通过去除游离铕珠而提高了复现性、敏感度和检测背景。检测盒含有条形码能让阅读器扫描有效期、批号和方法类型。将信息由阅读器传送到LIS的自动化解放了操作者，使他们不必再为人工阅读记录类似信息。

荧光性阅读器的设计是用于限制系统和操作者之间相互作用的次数。阅读器指令的设计是为了让操作者能够通过验证号码来进入系统，插入即将被阅读的检测盒并按下开始键开始检测（见图3）。在读取结果之前不需要其他的相互作用，之后移出并丢弃检测盒。

虽然Nexus Dx POC检测平台在技术上不是一次革命性的进步，但其在已接受的侧向流动检测设计方面是一种进化性的前进。通过更新模式、采用新技术、添加阅读器，开发出的POC检测能够满足多数检测类型和市场的需要（包括发展中国家的需要），而且该系统保持了低费用、大容积产量的潜能。

快速fluID检测
定性多分析物检测的一个例子是正处于积极研发中的fluID快速流感测试（见图4）。该季节性检测可同时检测流感A型和B型，以及亚型A、H1、H3。处于研发中的非季节性检测卡检测流感变体（H5）。虽然两种类型的检测是在相同的阅读器上进行的，但每个都有独立的方法文件来分析检测结果。

图4 该图表示的是fluID流感检测中与样本应用有关的检测线的结构。

来自两个研究中的数据在开始临床试验之前深入探查了新检测方法的性能。第一个研究使用滴度培养病毒检查了季节性流感A和B分析物的分析性能。每株病毒有TCID50滴定度，且每一个都进行了稀释，直到检测中不再产生信号。每次稀释都采用市场中的POC A/B流感检测和临床条件下使用的获得验证的聚合酶链反应（PCR）检测进行了测验。图5展示了对数标尺上比较模式的数据。

图5 表示的是fluID检测中一系列培养的和TCID50滴定肝脏流感病毒株的测试结果，其中fluID检测是由Nanogen公司验证的A, B, RSV PCR检测，并且是一种商业上可用的可视化阅读流感A/B检测。新的fluID检测的敏感度与目前市场上的POC流感A/B检测相比有了明显改善，且fluID检测的敏感度接近PCR的敏感度。FluID检测的平均分析敏感度比市场中PCR检测高2个对数。

稀释敏感性研究提示A和B分析物的平均敏感性与市场引领的流感A/B POC检测相比提高了2个对数（有些例子提高了3个对数）。液体检测的敏感性仅比PCR低1-2个对数。

在第二个研究中，临床样本是在最近的流感季节中从澳大利亚人群中采集的。因为只鉴别出了一份B阳性样本，本次分析仅限于A分析物。采集到的棉签放入1ml滤过性病毒运输媒介（VTM）中，并按照标准协议充分混合一分钟。样本被运送到Westmead医院（澳大利亚新南威尔士州）的病毒实验室内，并在那里对每份样本进行培养、冷冻。第一次融化后，VTM中的样本在fluID检测中进行测试，方法是将一个新的棉签浸入样本中然后按照所描述的检测进行处理。表1中的数据优于相互矛盾的清晰度。

表1  121份鼻咽样本的检测结果，其中通过1分钟的涡流对样本中的病毒运输媒介进行了洗提；经过上面分析盒的单向冻结-解冻环节之后进行检测。使用有效的PCR检测、Nanogen A,B,RSV检测测定出了5份假阳性样本。在5份培养的（阴性）/fluID（阳性）样本中，PCR检测出了3份阳性样本。根据这些结果，fluID检测的敏感度、特异性、PPV和NPV分别是92%, 98%, 92.6%, 和 98%。

采用PCR出现相互矛盾的清晰度后，来自这一小型临床前研究的数据表明：虽然fluID检测遗漏了两个培养阳性，但它在培养漏检的五份样本中检测到了流感病毒。结果提示fluID检测采用通用的VTM样本可能与培养有相等的性能。

NT-proBNP
设计的Nexus Dx系统是一种定量平台，提供的检测性能与全标度分析系统类似，但其费用低，是一种15分钟内可获结果的POC检测系统。例如，Nanogen使用标准批号研发的数据已说明该系统能定量检测到的

NT-proBNP最小量是3.5pg/ml、检测极限是0.3pg/ml、检测批号范围是3个，但差异系数小于5%（见表2和图6）。这些数据表明Nexus Dx平台具有与大型分析系统同样的性能。

表2  将重组NT-proBNP的稀释液系列在马血浆中进行稀释，并重复性地在标准检测中对体积为40 ul的稀释液进行检测。研究所得数据如上所示，平均结果如图6剂量反应曲线中所示。

图6  Nanogen的标准NT-proBNP检测表现出的检出限是0.38 pg/ml，定量检出限是1.28 pg/ml，%CV小于5%。

检测工作流程
运行棉签型fluID快速流感检测的步骤如图7所示。该检测的设计具有较长的培养时间，从而获得更稳定的结果端点。采用这种方式后，例如，如果繁忙的POC工作环境中的某一操作者读取检测结果时时间推迟了10分钟，检测结果仍然会保持不变。单一fluID检测的执行如下：收集到棉签后，操作人员将其置入样本试剂装置管内，盖上盖，中断按钮阀门并取出萃取试剂。操作人员将样本试剂管摇晃或混合10秒钟，然后将样本试剂管放入检测盒内。快速按下洗涤缓冲液按钮后，会排出洗涤缓冲液。执行这些分析前步骤大约需要30-45秒钟的时间。

图7 简便的棉签型侧向流动检测工作流程

检测
检测持续20分钟，采用荧光阅读器读取数据（读数、打印和显示结果所需要的时间是30-40秒）。阅读器能扫描条形码信息，确认有效期，提示正确的方法文件，记录患者验证号码（如果放入检测盒的话），分析检测结果，打印最后结果，并且储存最近的100个检测结果。该阅读器也能直接将数据下载到LIS中或非直接性应用POC检测1A协议。总的检测时间是22分钟。

结论
Nexus Dx多分析物POC检测系统是定量和定性检测的平台。该检测系统对NT-prpBNP检测的已证明敏感度（检出限）是0.38pg/ml，定量检出限是3.5pg/ml。对于流感检测来说，该系统的分析敏感度与现有的POC检测系统相比提高了2个对数。
Nanogen研发新的第三代侧向流动检测系统的努力已表明我们有能力改善硝化纤维膜型免疫检测。同时，可保持原始侧向流动理念的重要有点，包括费用低的简单、快速检测。

摘自：www.IVDtechnology.com