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1. 前言
启动子高度甲基化是恶性肿瘤基因转录中的一种很常见的现象，被视为细胞恶性转化的标志之一。DNA 甲基化分析是一种基因检测工具，用于早期癌症检测、风险评估与治疗疗效评估，具有非常诱人的前景。
DNA甲基化检测最常用的方法主要依赖于亚硫酸氢钠对基因组 DNA 的处理，将胞嘧啶转换成尿嘧啶，未修饰 5-甲基胞嘧啶。经过修饰的基因序列发生改变，可对后续的 PCR 扩增产物中的甲基化胞嘧啶进行鉴别。
通过亚硫酸测序分析，可对基因甲基化情况进行最准确的评估，可鉴定单甲基化胞嘧啶。并开发出了几种更加简单的以 PCR为基础的方法，这些方法对于小规模的研究性实验室来说，非常重要。这些方法较新、较简单、容易操作。高分辨率熔点分析方法（HRM）即是这几种方法之一。HRM 是基于溶液中 DNA 的“熔解”特性。该方法的原理是，通过基于不同熔解温度的熔点分析，区分出具有不同甲基化胞嘧啶含量的双硫酸处理的 DNA 模板。由于不需要昂贵的探针与内参基因进行标准化处理，HRM 是一种相对简单，而成本又较低的方法。通过 HRM 技术的应用，可对扩增子内所有 CpGs 进行分析，根据熔解曲线的形状，可对同源性及异源性甲基化进行区分。这一点非常重要，因为启动子 CpG 岛的甲基化模式通常为非同源性。
对于生物标志物检测来说，冻存组织是一种非常重要的资源。于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织上，对主要分析方法的性能进行了检测。当前研究的目的，是对结直肠癌个体冻存 FFPE 组织上启动子甲基化检测 HRM 分析进行评价及确证。
2. 材料与方法
对照与研究样本
将CpGenome通用甲基化 DNA（Chemicon/Millipore,Billerica, MA）与来自外周血单个核细胞（PBMNCs）DNA 作为甲基化与非甲基化对照。于非甲基化 PBMC DNA 中对甲基化对照 DNA 进行稀释处理，生成甲基化标准品（50%、25%、10%、5%、1% 与 0.1%）。HRM 检测优化后，我们对来自于结直肠肿瘤个体的冻存组织样本进行了分析。
DNA提取与双硫酸修饰
对来自于培养肿瘤细胞系的健康志愿者 PBMNC DNA 与 DNA 进行分离。对于来自于冻存研究组织的 DNA 分离物来说，使用的是来自于 FFPE 肿瘤组织块的 10 μm 厚度的切片。 MethyLight 检测有关 MGMT 与 APC MethyLight 检测说明，见前期文献描述。简言之，于 LightCycler? 480 仪器上进行 PCR。
高分辨率熔点分析
于 LightCycler? 480 仪器（罗氏）上进行 PCR 扩增与 HRM。考虑到 FFPE DNA 呈高度片段化，大的扩增子会导致熔点分辨率降低，扩增子被设计为不超出 200bp。
使用 Gene Scanning 与 TM Calling 软件模块（罗氏）进行 HRM 数据分析。通过对代表着 PCR 产物熔解前及熔解后两个标准化区域的计算，对熔解曲线进行标准化处理。通过这种计算，可对具有不同起始荧光强度的样本进行直接比较。标准化温度转换熔解曲线图显示，随着温度升高， 荧光强度降低。
3. 结果与讨论
对标准稀释品进行检测，测定 HRM 检测的灵敏性。通过所有 HRM 检测（APC、MGMT、GSPT1，与 PTEN），我们可以在保证重现性的基础上，于非甲基化 DNA 背景中，检测到 1% 的甲基化的 DNA（图 1A-D）。
图1：MGMT（A）、APC（B）、GSTP1（C）与 PTEN（D）甲基化 HRM检测灵敏性。以三种方式显示甲基化标准曲线。100 % 甲基化显示为红色、50 % 甲基化显示为橙色、25 % 甲基化显示为绿色、10 % 甲基化显示为蓝绿色、1% 甲基化显示为黄色、0.1% 甲基化显示为紫色，0 % 甲基化显示为蓝色。
下一步，我们对福尔马林固定、是蜡包埋处理对启动子高度甲基化检测的作用进行了评价。我们能够对 APC启动子高度甲基化进行检测，检测可靠性较高。图2（A-C）显示，新鲜与 FFPE 细胞系 DNA APC HRM 检测重现性与一致性较近似。
图2：使用来自于不同肿瘤细胞系--甲基化标准品（黑色曲线、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）与样本（彩色曲线）均呈三重显示。
4. 结论
我们的研究进一步证实了 FFPE 组织启动子甲基化分析定量 HRM 的适用性。FFPE 组织是正常对照与病变组织最大的样本材料来源，这些组织的应用，对于研究来说具有不可估量的价值。方法学评价对于实验稳定性的确证非常重要，可辅助确立该检测方法是否适合作为一种研究工具以及可能的常规检测手段。
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