利用插入染料或FRET探针进行可靠、低成本PCR扩增技术的性能使得这款检测仪在临床中的应用增加。
George Maltezos, Wasun Chantratita, Alvaro Gomez, Frank Gomez, Emil
Kartalov和Axel Scherer
已经开发出了一种稳健、可携式、蓄电池供电型实时聚合酶链反应（PCR）系统。该系统与目前可获得的最先进设备相比在对病毒核酸扩增方面有着同样的准确性，且成本较低。这种低价格的PCR病毒鉴别系统能够被世界上的偏远地区利用，并可为流行病的爆发建立一个早期预警系统。本文比较了便携式实时PCR系统和传统的台式设备。同时本文还证明了在病毒量较低的临床环境中对H5N1禽流感病毒、
HIV/AIDS和其他普通病毒的鉴定能力。
微型化扩增系统展示出了精确的温度控制，从而使其产生了至少与较大型商用仪器同等的扩增效率和特异性。精确的温度控制还使我们可以利用较便宜的插入染料作为荧光报告因子，从而进一步降低了费用，增加了PCR检测的可存取性。
自二十世纪九十年代中期以来，实时PCR对生物化学产生了革命性的影响[1-4]。该类反应利用可选择性引物来同时对样本中的特异性核酸分子进行鉴定和扩增。像出现的那样，通过允许使用者对PCR过程进行监测，实时PCR给出了样本中DNA浓度的信息，克服了很多早期终端PCR的局限性[5,6]。
最新的进展包括利用Peltier接头对纳微升和豪微升体积分析物进行精确、快速热控制技术以及采用实时逆转录PCR对RNA序列进行扩增的技术[7-12]。实时PCR在病毒鉴定和病毒量的测定上有着无与伦比的敏感性。然而，传统上这样的诊断检测仅在大型、昂贵的热循环器中才能进行。
病毒性流行病是公共健康逐渐关注的一个问题，且事实证明其带来的社会代价很高。例如，近来爆发的SARS的预算费用范围是100到300亿美元。即使在1994年苏拉特局部爆发的瘟疫中，印度支出的费用接近20亿美元，而1997年香港爆发的禽流感使其在家禽类产业、商业和旅游业中的损失达到数百万美元[13]。
预计采用低成本荧光报告因子的小型、廉价仪器的引入将致使PCR检测的广泛使用，目的是通过有效的病毒爆发监测系统来阻止流行病的出现[14]。这种微型系统可能会容易、迅速地用于机场、农村地区以及所有需要快速、特异性病毒检测的地区。床旁PCR分析可能会最终带来病毒疾病的早期诊断和更加有效的患者监测。
材料和方法
便携式实时PCR热循环器样机包括Marlow
Industries（达拉斯）生产的、焊接到冷却器换热夹套上的Peltier接头热电冷却器，其中夹套是玻璃试管所要插入的地方（见图1）。Oven
Industries（密切尼克斯堡，PA）开发出的程序可控热控制器被用来获得温度升高结果。Tenergy Corp.（菲蒙市）生产的含有12NiMH
10,000-mAHD-太阳能电池的蓄电池组件能够为该设备提供进行100次PCR的电力，而运行PCR的次数取决于特异性热循环器的属性。
图 1. 便携式PCR设备的图解示意图
虽然采用这种样机设备的分析每次仅限于对一个样本进行操作，但该装置在仅增加额外Peltier元件成本的情况下就可扩展为同时接收多个样本的设备。包括PCR
Peltier头、控制器和蓄电池的热循环器装置的规格是200 mm × 200 mm × 140 mm。进行循环变温加热时不需要额外的电力设备或计算机。
为了进行分离曲线和实时扩增荧光测量，将Cree（达拉谟）生产的大功率480nm ±10 nm 700-mA Xlamp
LED照明灯和Intor（索科罗）公司的520nm ±10
nm过滤的硅PIN光电二极管检测器集成到热循环器中。作为比较，还采用了Hamamatsu（日本盐田市）公司的冷却CCD光电倍增管来检测荧光性。PIN光电二极管的输出是采用Keithley仪器公司（克利夫兰）的匹克安培计进行监测的，并且利用美国国家仪器公司（奥斯丁）的自定义虚拟仪器程序进行了分析。
为了检测标准热循环器，采用标准装置和Roche应用科学（印第安纳波利斯）的光热循环器PCR系统对慢性病毒DNA进行了扩增。临床样本是通过Ramathibodi医院（印第安纳波利斯）的一个研究小组获得的。核酸是采用NucliSens简易MAG平台从200μl血浆、全血或脑脊液中分离得到的，其中简易MAG平台来自bioMérieux公司（法国Marcy
l’Étoile），用于总核酸的萃取。填充物中DNA、RNA和总核酸的洗提采用的是30-50 μl洗涤缓冲液。
HIV血浆样本病毒量的测定采用的是Roche分子系统（普顿）的Cobas AmpliPrep/Cobas Amplicor
HIV-1监控测试v1.5。准备了mastermixes
PCR反应，且将相同的20µl样本等分后在光循环器台式系统和便携式PCR系统中同时进行分析。所有的扩增和测量都执行三次。具体的PCR装置图都包含在电子补充信息中。
结果
标准实时PCR装置的检测
为了评价标准热循环器中目标物扩增的选择性和有效性，在使用SYBR绿色插入染料进行慢性病毒DNA扩增过程中测量了荧光强度。在便携式PCR系统和Roche
LightCycler中对来自单一样本的等分部分进行了同时反应。
每个系统的阈值循环周期（如，观察到荧光信号到达阈值所经历的循环次数）大约是14。扩增后生成的熔解曲线如图2所示，表现出了反应的特异性。图3表示的是一个从标准设备中获得的典型扩增曲线。
图2 标准设备中对慢性病毒DNA样本进行的扩增。 之后其与商业用仪器（紫色）和装有硅PIN二极管的便携式PCR设备（绿色）相熔化。
图3 实时荧光监测系统采用SYBR绿色I作为报告分子展示出的慢性病毒DNA扩增
临床样本的扩增
在Ramathibodi医院，采用临床血浆、全血和CSF样本进一步检测了便携式PCR仪器。通过在LightCycler
I台式系统和PCR系统中采用商业可得染料比较扩增效果的方法，评估了便携式PCR系统的敏感性和选择性。利用LightCycler仪器中获得的熔解曲线分析了以上两个系统的生成产物。结果表明：对一部分有临床意义的病毒来说，便携式PCR系统的性能可与Light
Cycler相比较或者优于LightCycler的性能。
H5NA禽流感
H5N1流感病毒菌株会造成世界性流行病的潜能最近引起了寻找有效鉴定技术决策人的极大关注。因此，用来自感染H5N1鸡群的样本验证了便携式实时PCR仪器。采用医院之前最佳的实时PCR引物和热循环器属性首次对体外转录H5基因RNA进行了扩增，用作阳性控制，然后分析了感染鸡样本中的H5NA病毒RNA。利用PCR系统扩增了几种H5N1等价物的浓度，从而来模拟不同病毒量产生的效果。
图4 H5N1（禽流感）荧光熔解曲线的阴性派生物。在Roche
LightCycler（黑线）和便携式PCR（灰色线）系统中对感染鸡样本进行了45次PCR循环扩增。
通过使用LightCycler仪器运行熔解曲线的方法分析了扩增后的产物。图4表示的是H5N1样本的杂交探针熔解曲线（如，从扩增产物中分离杂交性探针），该曲线将荧光的阴性派生物划为温度的一个功能。Roche
LightCycler和便携式实时PCR系统获得的样本熔解曲线没有很大的差别，而且表明杂交探针的熔解温度是62.9℃（±2.5℃）。仔细检查还发现便携式仪器得出的样本熔解曲线峰值有所降低，原因可归于扩增过程中较低的非特异性结合以及底物-二聚体相互作用的降低。
图5 HIV/AIDS荧光熔解曲线的阴性派生物。在Roche
LightCycler（黑色线）和便携式PCR（灰色线）系统中通过65次PCR循环对人血液样本进行了扩增。
HIV/VIDS
HIV感染的有效治疗和预防依赖于早期检测，而在世界范围内的临床中引入低价格的PCR检测系统会提高早期检测。PCR能在HIV感染后的前两周内就能鉴定出HIV病毒。在几种不同的病毒量情况下，采用与HIV-1
gag基因（基因库登记号码：EF680874）一致的引物在LightCycler和便携式PCR仪器中分析了含有HIV的血液样本。该方法使用了两个探针型杂交混合法检测了全部的HIV亚型。
图6 乙型肝炎（HBV）荧光熔解曲线的阴性衍生物。在Roche
LightCycler（黑色线）和便携式PCR（灰色线）系统中对人血液样本进行了扩增。
65次热循环后，每个稀释病毒量的典型杂交探针熔解曲线如图5所示。DNA溶解温度大约是56℃（±2.5℃），与采用LightCycler和便携式PCR系统扩增的样本结果类似。通过探索病毒量的最低范围，发现两种仪器的最终敏感性类似。因为患者与患者之间所服用的相对较贵的药物剂量是不同的，所以在治疗期间能时时监测患者的病毒量并适当调整剂量是有益的。
乙型肝炎
为了验证PCR仪器能够对DNA和RNA两种病毒进行扩增，对乙型肝炎（HBV）和普通DNA病毒进行了扩增试验。采用与HBV聚合酶基因（基因库登记号：DQ995858)一致的引物，在LightCycler和便携式PCR仪器中对含有HBV的血液样本进行扩增。图6表示的是45个循环后，LightCycler和便携式系统扩增子SYBR绿色染料熔解曲线。溶解温度被确定为79.6℃（±3.0℃）。数据表明便携式PCR仪器能够对DNA和RNA两种病毒进行扩增，且获得的结果与大型商业可得扩增系统的结果一致。
单纯性疱疹I和II
通过检测含有单纯性疱疹I（HSV-I）和单纯性疱疹II（HSV-II）菌株的人CSF，便携式PCR系统能对同一样本中的几种病毒菌株进行扩增和分型。HSV-I和HSV-II的扩增子SYBR绿色染料熔解曲线峰值分别是54℃（±2.5℃）和67.2℃（±2.5℃）（见图7）。能够区分这两种峰值的性能表明便携式PCR系统能够对同一样本中的双重或共同感染病毒进行扩增和辨别。
图7 HSV I和HSV II（单纯性疱疹）混合物荧光熔解曲线的阴性衍生物。在Roche
LightCycler（黑色线）和便携式PCR（灰色线）系统中通过45次PCR循环对人血液样本进行了扩增。
巨细胞病毒
与临床有关的另一病毒——巨细胞病毒（CMV）也是通过使用与人巨细胞病毒UL22基因（基因库登记号：X92746)一致的引物对人血液样本进行扩增获得的。图8表示的是采用LightCycler和便携式PCR系统在45次PCR循环后得到的扩增子SYBR绿色染料熔解曲线。DNA溶解温度大约是85.8℃（±3.0℃）。
图8 巨细胞病毒（CMV）荧光熔解曲线的阴性派生物。在Roche
LightCycler（黑色线）和便携式PCR（灰色线）系统中通过45次PCR循环对人血液样本进行了扩增。
图9 采用SYBR
绿色染料扩增后CMV毛细管的荧光图像：（a）便携式设备中的阳性CMV样本；（b）便携式设备中的阴性样本；（c）LightCycler中的阳性样本；（d）LightCycler中的阴性样本。
图9表示的是含CMV（A和C）样本或阴性对照品（B和D）的热循环毛细管的荧光性图像，其中的毛细管已经经过了样机系统（A和B）或Roche
LightCycler（C和D）的处理。与阴性对照物相比，LightCycler显示出了较强的信号，这种现象可由80.7℃时适度的引物-二聚体峰值来解释（见图10）。而在样机PCR系统扩增的阴性对照样本中没有出现这样的峰值（见图10）。
图10.
采用SYBR绿色染料扩增的CMV阴性对照物荧光熔解曲线的阴性派生物。LightCycler中运行的阴性对照物产生了一个扩增产物荧光信号，而便携式设备中运行的阴性对照物没有出现这样的信号。
讨论
便携式实时PCR系统的部分构造价格是500美元，具有简单、可扩展、便携式和稳定的特征。虽然蓄电池组是本系统中最重的一个组件，但该系统整体重量低、体积小，使其真正成为便携式仪器。
PCR扩增过程中，PIN-型固态检测器为典型荧光信号的实时测量提供了准确的解决方案，其中正规电子设备可以容易地对荧光信号进行测量。便携式PCR设备加热并冷却玻璃毛细管，而这些毛细管同样也通过Peltier效应用于实时LightCycler仪器中[7]。PCR样本中测量得到的典型温度升高曲线证明热循环变温加热的温度误差是0.1℃。因为升温速率很大程度上决定了PCR的扩增时间，因此将温度升高速度增加到30℃/s而把反应时间降低在10分钟之内是有可能的。但在本文中，采用的标准升温方案是台式PCR系统的最佳方法。
采用类似SYBR Green I的插入型染料探针而不是昂贵的FRET探针时，CMV PCR过程中仔细分析阴性对照样品会发现意外的便携式PCR系统优点。图9和图10展示的是LightCycler系统中引物-二聚体扩增的迹象，而不是便携式PCR系统中的扩增迹象。在LightCycler扩增的HBV阴性对照品熔解曲线分析中同样发现的假峰值并没有在便携式系统扩增的阴性样品中出现。
微型化的最重要的优势是随PCR反应器热质量降低而出现的热反应时间的缩短。微型化系统利用大约30℃/s的升温速率就能加热和冷却20μl样本，而更小的样本体积还能进一步增大温度升温速率。Peltier冷却系统中对一400nl的样本实现了大于100℃/s的加热速率和接近90℃/s的冷却速率。快速的升温使得PCR扩增所需要的整体时间由数小时降低到数分钟。但是，必须仔细权衡减少分析物体积的优势与扩增含稀释病毒量样本的困难；较大的样本体积能提高测定敏感性。10-20μl是目前PCR系统最佳的体积大小，而本研究中使用了20μl的样本体积。
结论
本文描述了具有精确温度控制的一种便携式实时PCR系统，并展示了该系统对几种临床上比较重要的病毒的测定。利用插入型染料或FRET探针执行可靠、低成本PCR扩增的性能将会使这以敏感性工具在禽畜监测、法医测试和医疗诊断领域中获得广泛应用。
致谢
本文作者感谢Chutatip Srichantaratsamee，Konstantin Taganov，John Zhong，William F.
Anderson和Koichi Okamoto对本文提供的帮助和贡献。研究所用资金是由Boeing Corp. 在SRDMA项目中以及国家健康研究所在R01
HG002644 和 R00 EB007151中提供的。
摘自：www.IVD Technology.com
