[转帖]叶酸--血清和红细胞分析的临床用途

叶     酸

血清和红细胞分析的临床用途
Cynthia Balion，d Bhushan M. Kapur

研究家第一次证明孕妇叶酸水平与新生儿神经管缺陷（NTD）存在相关性是在二十世纪六十年代。现在，已经知道低叶酸水平是NTDs的一个风险因素，且1998年美国食物和药品监管局对谷物类食物产品制定了强制要求，从而保证那些未意识到自己怀孕的女性不会在神经管闭合的重要阶段让其胎儿遭受损伤。该政策制定的一个主要推动因素是以下认可：除正常的食物叶酸摄取外，孕期叶酸的补充明显降低NTDs的发生率。事实上，现在很多国家都通过强制或自愿实施面粉配方规定来降低新生儿NTDs的风险。
自从实施含有叶酸的面粉配方后，普通人群中的叶酸浓度一直都在升高。所以现在很少会看见叶酸水平低的情况。尽管孕妇中叶酸水平对新生儿的健康是非常重要的，但实验室要求的大部分叶酸检测都是为了调查非妊娠患者中伴维生素B12缺乏的贫血症状。
本文将描述叶酸的新陈代谢、叶酸缺乏的原因、临床作用和发病率，同时还描述了有关诊断临界值的证据和叶酸检测的临床意义。

叶酸事实
叶酸（蝶酰谷氨酸）是各种代谢反应中一碳物质的载体（见图1）。这种维生素是核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂和荷尔蒙合成时所必须的物质。叶酸还是新一代蛋氨酸的一部分，而蛋氨酸是染色体或非染色体甲基化作用必需的成分。
人体内缺乏合成叶酸的酶，所以直接摄入叶酸是有需要的。营养学家估测人体内可贮存10-100mg叶酸，而正常4个月的代谢仅需5-10mg就已足够。
叶酸直接摄入的丰富来源包括绿色叶类蔬菜、水果、奶制品、谷类、酵母类和动物蛋白质。不过在烹饪过程中会损失食物中的大部分叶酸。美国为成年人推荐的食物参考摄取量是400 μg/天，其他国家也有类似的建议。对于儿童来说，所推荐的DRI是比较低的，但对处于妊娠和哺乳期的妇女所推荐的叶酸水平是比较高的。天然叶酸的有效利用率是50%，强化食品中叶酸有效利用率是85%，而以补充剂形式服用时的有效利用率几乎是100%。

图1 叶酸新陈代谢

红色字体表示的是在有5-MTHF血液中发现的主要叶酸类型，超过其他所有类型（82-93%）。
缩写词: B2,核黄素; B6,吡哆醛磷酸盐; B12,钴胺素;DHF,二氢叶酸; DHFR,二氢叶酸还原酶; DMG,二甲甘氨酸; Dtmp, 脱氧胸苷5’-磷酸盐; dUMP, 2’-脱氧尿苷-5’-磷酸盐; MS, 蛋氨酸合成酶; 5-MTHF, 5-甲基四氢叶酸; MTHFR, 亚甲基四氢叶酸还原酶; SAM, S-腺苷甲硫氨酸; SAH, S-腺苷高半胱氨酸; SHMT, 丝氨酸羟甲基转移酶; THF, 四氢叶酸; TS, 胸苷酸合成酶; UMFA, 为代谢叶酸.

叶酸缺乏的原因
叶酸缺乏的原因主要有四类：1）营养不良；2）不充分的吸收（如吸收不良综合症，胃切除术）；3）需求增加（如妊娠，透析）；4）药物干扰。通过一碳方式进行新陈代谢并用于治疗癌症的药物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶，可能会导致功能性叶酸缺乏的结果。原因是，这些药物能抑制叶酸通道中的关键酶，如甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶（DHFR），5-氟尿嘧啶抑制胸苷酸合成酶（TS）。叶酸吸收降低也能发生类似二甲双弧、消胆胺、抗痉挛药和H2阻断剂等药物中，但这些都是在饮食叶酸摄入量较低的情况下发生的。

叶酸缺乏的临床作用
已有大量试验性、观察性和随机临床试验（RCT）研究调查了叶酸水平和心血管疾病、癌症以及认知能力之间的关系。整体上来说，还没有充分的证据表明叶酸在这些慢性疾病中起到关键的作用。叶酸缺乏

引起的病理生理结果中已经显示出有重要影响的两个基本结果是巨成红细胞性贫血和NTDs。

巨成红细胞性贫血
叶酸缺乏的特点以及最可靠的定量指示是贫血的血液学表现。当叶酸水平不足以进行细胞代谢时，伴有快速细胞分裂的骨髓和其他组织中会发生巨成红细胞改变。与成熟红细胞和超级片段多形核白细胞相比，缺陷性DNA合成会导致大量生红血球前细胞体的生成（大红细胞，大卵形红细胞）。维生素B12缺乏时也会出现这些细胞变化。尽管叶酸补充会消除维生素B12缺乏性贫血，但其不能治疗甚至可能会恶化与维生素B12缺乏有关的神经学疾病。

妊娠中叶酸缺乏
妊娠时因血液体积和活性细胞增殖速率的增加，需要强制要求孕妇补充额外叶酸。其中活性细胞增殖速率对胎儿胎盘的生长和发育是十分重要的。此外，妊娠期间叶酸分解代谢速率会逐渐增加，并在胎儿生长到最大的妊娠晚期时间达到最高点。叶酸分解速率的增加好像是细胞生物合成增强阶段维生素加快分解的结果。
发生NTDs的原因是胚胎发育早期神经管闭合失败。75%受NTD-影响的妊娠都会以流产或死产结果而结束妊娠。这种致死或严重妨碍性先天缺陷的发生率会因地理位置、社会经济状况和种族的不同而不同。
研究者推测NTDs是多种因素共同进展的结果，可能受到几种基因和环境因素的共同影响。二十世纪九十年代早期的两项RCTs表明了叶酸在预防NTD上的作用。现在已经很好地证实了孕期补充叶酸能降低有NTDs的婴儿出生的风险。

叶酸缺乏的患病率
1998年启动的一个公共健康活动强制性要求美国、加拿大和哥斯达黎加生产的谷类食物中要含有叶酸。这项活动开始后，这几个国家的NTDs发病率立即分别降低了26%、46%和35%。该策略的成功使得智利、南非和澳大利亚也开始强化食物配方。目前，新西兰、英国、、、爱尔兰和荷兰等国家也正在推进同样的策略。
来自国家1988-2004健康和营养检测调查（NHANES）的数据显示出了这个时期内血清叶酸和红细胞（RBC）叶酸的变化（图2）。强化饮食配方后第一次调查中开始大幅度上升，低于随后两次调查中的峰值。事实上，数据显示出了预防后血清叶酸和RBC叶酸缺乏发病率的改变，其中血清叶酸缺乏定义为<3 ng/mL或<6.8 nmol/L，RBC叶酸缺乏定义为<140 ng/mL或<318 nmol/L。1988-1994年的调查中，15.6%的个体都有血清叶酸缺乏，而30.5%有RBC叶酸缺乏。2003-2004年的调查中，这些数字已经分别降低到0.5%和4.0%。60岁及60岁以上的参与者最不可能出现叶酸缺乏：仅有0.1%血清叶酸水平不足，且仅有2.1%缺乏足够的RBC叶酸。
NHANES在普通人群中进行的有关叶酸水平的研究采用了医学研究院（IOM）临界值，其中临界值来源研究中的叶酸测量采用了微生物测定法，并将结果与采用Quantaphase（Bio-Rad实验室）方法获得的检测结果进行了比较。Quantaphase检测偏差用于对这些临界值进行调整时，整个预防后调查阶段划分为血清或RBC叶酸缺乏的个体百分数会分别降到<0.05% 和< 0.5%。
同样，加拿大社区实验室采用Quantaphase检测得出的报告是：所研究的人群中，血清叶酸缺乏(<1.5 ng/mL或<3.4 nmol/L)由食物预防开始前的0.52%降低到预防实施后的0.22%；而RBC叶酸缺乏(<95 ng/mL或<215 nmol/L)由1.78%降低到0.41%。另一个加拿大实验室2004年-2006年对19,885次RBC叶酸检测进行的分析发现：在Roche诊断模块分析仪E170（未公开数据）上采用叶酸检测时仅有0.3%的样本位于调整后的临界值229 ng/mL (520 nmol/L)。

图2  血清和红细胞叶酸频率分布
  

根据1988–1994, 1999–2000,2001–2002和2003–2004年国家健康和营养检测调查结果绘制的整个美国人群中血清和红细胞（RBC）叶酸频率分布。
来源： Pfeiffer, C. M et al. Am J Clin Nutr 2007;86:718–727. Used with permission.

未进行新陈代谢的叶酸
除了叶酸水平增加之外，研究者在血液中还发现了更多的循环性未代谢叶酸（UMFA）。NHANES 2001-2002显示，1,330名≥60岁的参与者中38%有可检测的UMFA (4.4 ± 0.6 nmol/L)。UMFA数量大约占所有被检测的血清叶酸的6%。该种叶酸形式的存在提示DHFR将叶酸氧化形式转化为简单形式的能力已经被超越。LUMFA仅来自于补充食物和强化食物；它不会从天然叶酸来源中形成。
每天大约摄入300 μg叶酸已足够在血清中检测出UMFA。尽管缺乏UMFA是否有特殊生物效应的证据，但有关该主题的数据正慢慢浮出。例如，研究者已报道UMFA和低维生素B12与认知功能低下有关，从而突出了与UMFA有关的神经精神病风险可能性。

血清和RBC叶酸的测量
与单个分子实体不同，叶酸含有一组叶酸派生物分子。血液中最主要的叶酸形式是5-甲基四氢叶酸(5MTHF)，占总被测叶酸的82-93%。检测同时测量了其他叶酸形式，包括UMFA、四氢叶酸（THF）、5,10-亚甲基-THF和5-甲酰基-THF（图1）。
二十世纪七十年代研究者开发蛋白质结合检测之前，实验室就已经采用微生物学检测测量叶酸。今天，可获得几种液相色谱-质谱分析法，但多数方法都不适用于临床测量。
临床实验室采用的大多数方法都是自动化、非同位素方法，而这些方法依赖的是叶酸结合蛋白。叶酸结合蛋白检测同时又受到几个因素的影响。例如，叶酸结合蛋白对多聚麸氨酸盐（PGA）的亲和力大于对单麸氨酸盐的亲和力，而PGA能更好地与MTHF结合。检测中蛋白质数量和pH也会对结合能力产生影响。稀释线性有时也会成为一个问题。与微生物学检测相比较，蛋白质结合检测不会与抗生素或叶酸类似物发生交叉反应，如MTX或甲酰四氢叶酸（叶酸）。
虽然血清叶酸水平随着饮食而出现明显波动，但RBC叶酸检测结果反映出了更多的组织叶酸贮存量。饮食中除去叶酸后，血清水平会在3周内降低，但RBC叶酸水平在3-4个月内会保持不变。尽管实际中检测是一样的，但RBC叶酸检测包括一步对样本的分析前处理。从该检测中获得的叶酸水平是一个计算出的数字，并将患者的血细胞比容考虑在内。表1给出的是血清和RBC叶酸检测特征的比较。

1 NHANES 1999-2002 (国家健康统计报告, Number 21; March 1, 2010)
2 NHANES / Westgard 变量数据库
3 CAP 调查2009 K-B (K-08) and K-C (K-11, FOL-05, FOL-06), 与所有方法平均值（%）对比的绝对方法差异。
4 基于微生物鉴定。没有采用当前免疫测定法并使用参考标准的对比研究。

还需要特别注意的是：对同一样本采用不同生产厂家检测获得的数值之间的差异在一部分上是检测各种叶酸形式的能力和使用的校准品类型造成的。图3表示的是来自美国病理学会能力调查的血清和RBC叶酸结果。图表中表现出的巨大差异极可能是由抗体对不同厂家使用的抗原（谷氨酸）差异所造成的。目前，叶酸检测还没有实现标准化,不过使用通用的参考标准能够降低检测之间的差异。正因如此，谨慎对来自不同实验室和发表研究的叶酸结果进行解释是及其重要的。

图 3  测量血清和RBC叶酸商业用方法之间的相关差异
数据来自采用选择性样本进行的2009CAP能力调查，代表了RBC叶酸和血清叶酸的高、低浓度。括号中给出的是所有方法的平均值。

叶酸缺乏诊断
1998年, IOM 回顾了文献，并将血清叶酸3ng/mL (7 nmol/L)值及RBC叶酸140 ng mL (305 nmol/L)值作为正常叶酸水平的提示。值得注意的事实是这些数值与血液学临床表现或和叶酸缺乏有关的DNA改变没有相关性。
虽然公众中有关叶酸水平的一致性意见很少，但孕妇中预防NTDs时引用最多的RBC叶酸浓度是900 nmol/L (400ng/mL)。该浓度水平是爱尔兰进行的一项大型、对比研究确定的，表明了RBC叶酸和NTD风险之间的剂量反应关系。在此浓度下，差异比是1.0，意味着孕妇所生胎儿有无NTD的风险比例是一样的。
即使获得了该指南，临床医生还是会经常发现患者的叶酸检测结果令人困惑，原因是实验室报道检测结果数值的方式是不同的。有些实验室仅仅报告参考区间，而其他一些仅提供阈值，有些则根据结果来自RBC叶酸检测或者血清叶酸检测而给出混合数值。另外，实际数值差异是很大的，有些实验室报告年龄阈值，其他则报告阈值或叶酸界线、正常或过量数值区间。这些不一致性的结果报告方法妨碍了临床对检测的应用。

叶酸检测的临床应用
临床医生一般将叶酸检测用来评估巨红细胞性贫血。这种临床惯例已根深蒂固，并在低叶酸缺乏发病的情况下继续保持。2001年，克利夫兰临床调查者努力来确定叶酸缺乏发病率，不管有和没有叶酸缺乏的患者之间是否存在叶酸检测的临床特征差异，也不管是否给那些叶酸缺乏患者给予了叶酸补充治疗。该研究发现仅1.7% (74 of 4,315)的血清叶酸值<2.8 ng/mL (6.4 nmol/L)。他们没有发现群组间叶酸检测存在临床特征差异，包括巨红细胞性贫血、非巨红细胞性贫血、大红细胞症/非大红细胞症贫血、痴呆/精神错乱/神经病和吸收障碍/营养不良群组。63例可获得医疗记录数据的叶酸缺乏患者中，24例接受了叶酸补充治疗。总之，作者推论临床对测量叶酸的应用因叶酸缺乏发病率较低、有限的临床实验指征数值和低叶酸值的较差反应而存在一定的问题。
其他研究也得到了类似的结论，包括一项关注处于医疗资源不足区域群体的研究。2004年在旧金山综合医院进行的该项研究发现0.51%（159例患者中有9例）RBC叶酸值<160 ng/ml (363 nmol/L)。与67名叶酸值高于上述阈值的巨红细胞性贫血患者相比较，仅有3名患者有巨红细胞性贫血。
不过，类似这些研究对降低叶酸检测数量并没有产生很大的影响。为了降低不必要的检测，汉密尔顿地方实验室医学项目派遣一名通讯者告知临床医生叶酸缺乏的罕见性。3年后，发现检测数量并没有发生改变，所以实验室决定通过要求临床医生与生物学家或血液学专家讨论的方式来限制检测数量。令人惊奇的是，尽管存在一些类似从仪表板中移除该项检测、将该新政策在系统内所有实验室中实施以及在某些需要进一步观察的儿科肠胃病科等特定临床领域内对新政策

进行讨论的问题，但实施这个方法时并没有遇到很多困难。之后一个月内，检测数量降低比例>99%，大大节省了支出费用。
总之，谷类食物加强叶酸配方后12年的研究结果显示：对疑似叶酸缺乏的患者进行叶酸测量已经不再是必要的了。叶酸缺乏现在是很少见的。结果是，执行这些测量的实验室需要重新考虑一下该如何向患者提供这项服务。例如，去除叶酸检测可能是有一定意义的。至少。实验室工作人员在对检测数值进行解释时应该考虑到方法偏倚。
今天，叶酸缺乏在美国已不常见，不应该再被考虑用来对贫血进行鉴别诊断。过度饮酒、营养严重不良、患有吸收障碍或正接受化学疗法的患者处于叶酸缺乏高风险中。但是，即使在这些高风险群组中，叶酸缺乏可能性也是很低的。评估叶酸水平是很重要，但妊娠和妊娠前有持续不可解释性巨红细胞性贫血以及叶酸缺乏的患者仍是需要关注的。

 摘自：Clinical Laboratory News
 编译：柏芳
（版权归原作者所有，本文仅供内部学习使用）

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