[转帖]免疫学技术

6.1. 流式细胞仪的细胞分析原理

待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。

6.1. 流式细胞仪的细胞分离原理

细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置使自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的细胞就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。

7. 酶联免疫分析技术

　1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称ELISA (enzyme linked immunosorbant assay)。

　　众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体成抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜相电子显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

7.1. 基本原理与类型

　酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

　　根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。

7.2. 间接法

此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加人待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。

　　操作步骤：①包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体；②加待检标本: 经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；③加酶标抗抗体: 再次温育(37℃2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；④加底物显色: 终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。

7.3. 双抗体夹心法

此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。

　　操作步骤：①用已知特异性抗体包被固相载体；②加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质；③加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体；④加底物显色，终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。

　　此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。

7.4. 竟争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

　　操作步骤：①用已知特异性抗体包被固相载体；②测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分；③加底物显色，对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比， 计算标本中待测抗原含量。

8. 免疫印迹技术

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。

好呀，很详细呀，顶！

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