[转帖]基因芯片技术及其在临床检验医学中的应用

李丽娟 2004-7-23 10:20:00 中华现代临床医学杂志 2004年7月 第2卷 第7B期

20世纪90年代初，人类开始启动人类基因组计划（Huˉman Genome Project，HGP），随着HGP即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐步进入后基因组时代（Postgen ome Era），向基因的功能及基因的多样性倾斜 ［1，2］ 。基因芯片技术正是随之而产生的一项新技术。它是将成千上万个寡聚核苷酸高密度地排列于面积很小的固相载体上，组成一个像计算机 芯片一样的微型实验室。它的出现使基因研究更趋于网络性，有了一个质的飞跃，摆脱了传统的Southern blot和Northern blot方法只能从事单个或几个基因相互关系研究的弱点。至今，基因芯片技术在医学各个领域的应用均已取得巨大突破。仅在此对基 因芯片在检验医学中的应用作一简述。

1 基因芯片技术概述

基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或显微点样技术，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进 行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，从而迅速得出 所要的信息 ［3］ 。其突出的特点是:集成化、微型化、自动化。基因芯片主要技术流程包括3个方面:芯片的设计与制备;靶基因的标记;芯片杂交与杂 交信号检测。基因芯片的制造，实际上就是将大量已知的探针，固定于选定的片基上，从而获得一高密度（通常探针的密度在65000 ～600000bp/cm 2 ）的探针阵列，目前，大致有3种制造技术:照相平板印刷术，机械打点法，喷墨法。结果检测用双色荧光检测。

2 基因芯片技术与医学检验学

基因芯片与检验医学的关系是密切的。首先，它为临床检验工作提供了一种全新的技术，使一些临床检验工作中难解决的问题成为可能。 实际工作中，实验室诊断在单一因素疾病诊断中具有决定性的意义，但由于人体和疾病的复杂性，单一指标在临床工作中的作用是有限的 ，这就往往需要多指标组合，而芯片技术正好提供了解决的思路。另外，有的实验室难题在高通量的检测中可以得到解决，如呼吸道、消 化道致病菌检测结核杆菌的培养，耐药性检测（可以测耐药基因）等等，国外现已有白血病诊断用芯片，高血压诊断用芯片等等。国内也 有人在研究致病菌分析用芯片。其次，基因芯片特别是lab on chip（芯片上的实验室）的研究会促使微加工技术的突破性进展，提高临床检验工作的高自动化，微量化，使床旁检验成为可能，并 且完全能进入家庭，对检验工作影响是翻天覆地的。另外，基因芯片是高通量的群体指标分析，无论从方法上还是临床医学上都是一种全 新的方式。人体和疾病是复杂的，传统单一指标的诊断方式对临床工作的帮助是有限的。因此，检验医学在医学中的重要性虽然在加强， 但是检验医学在实际工作中的作用却深受限制。基因芯片技术可能会给检验医学带来革命性进展。

3 基因芯片技术在临床检验诊断中的应用

3.1 在细菌检测中的应用 Anthony等 ［4］ 利用PCR引物扩增细菌的可变区段23sDNA，再与寡核苷酸芯片反向杂交，4h内报告结果，成功的鉴定了许多细菌，而且包括4 种混合感染菌，共检测的158份标本中，125株（79.1%）与血培养结果一致，未正确检出样品的主要原因是基因芯片上没有相 应的寡核苷酸探针以及没有获得相应的PCR产物。在对结核分枝杆菌及其耐药性的检测中，基因芯片更显示出了其广阔的应用前景。结 核分枝杆菌对利福平的耐药性与其RNA聚合酶的β亚单位（rPOB基因）有关。Head等 ［5］ 人应用基因芯片技术对rPOB基因序列进行扫描，PCR后1h内准确地鉴定出了耐药性结核分枝杆菌，利用该技术，还可同时检测结 核分枝杆菌的多种耐药性基因。

3.2 在病毒检测中的应用

3.2.1 在肝炎病毒检测中的应用 慢性肝炎病毒尤其是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的感染严重威胁着人类的健康。这些病毒的混合感染以及存在多种亚型、次亚型和耐药 毒株等给诊断带来一定的困难。基因芯片技术可对所有肝炎病毒的分型、变异、突变和病毒核酸含量进行高通量、平行检测。目前在肝炎 的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定（3TC）抗HBV治疗中出现的YMDD变异。我国华山医院与上海联合基 因公司合作，在国内率先开发、研制出检测3TC耐药位点的基因芯片，临床用于乙肝病毒YMDD变异检测。国内博道公司已研制了检 测丙型肝炎病毒（HCV）的基因芯片，他们选取40个HCV基因作为探针制备微阵列，对13个丙型肝炎患者血清和12个正常人血 清标本进行检测，结果准确率达100%。利用基因芯片技术将HBV、HCV的特异性基因片段固着于芯片上，能直接对血液中两种病 毒病原体同时进行检测，且可以将多种荧光标记样本同时杂交于一张芯片上，提高了检测效率 ［6］。

3.2.2 在艾滋病检测中的应用 HIV是严重危害人类健康的一种病毒，近年来随着其迅速地蔓延，受到了越来越多的重视。而HIV-Ⅰ逆转录酶在病人体内的突变， 对治疗起着重大的影响。早在1996年，M.J.Kozal等就利用基因芯片对HIV-IB亚型中的蛋白酶基因的多态性进行了分 析，这也是基因芯片技术被首次应用于临床实践。1998年，Hauser等 ［7］ 人应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测艾滋病病毒，对此病的早期诊断十分重要;同年，Kimizuka ［8］ 与Affymetrix公司合作生产了新一代的诊断试剂盒，用于检测艾滋病患者的HIV耐药反应。

3.2.3 流行性感冒病毒的快速诊断 流感病毒膜蛋白M1由其RNA第7节段编码。甲型流感病毒M基因编码252个氨基酸的M1蛋白，乙型流感病毒M基因编码248个 氨基酸的M1蛋白，均非常保守，且有型特异性，因此M基因可诊断流感病毒并对其分型。BTI-STD检测型基因芯片相对目前被广 泛应用的ELISA、PCR检测技术，其灵敏度、特异性高，假阳性率、假阴性率低，操作简便、快速，自动化程度高，结果客观性强 。

3.3 在肿瘤检测中的应用 目前，基因芯片技术已应用于癌相关基因突变的快速检测。1996年，Hacia等 ［9］ 用含96000个20聚寡核苷酸高密度阵列来检测遗传性乳腺癌和卵巢癌BRCAI基因第11个外显子3.45kb长度内所有可能 的杂和性突变，15例患者中发现14例有基因突变，包括点突变、插入突变与缺失等突变，在20个对照样品中没有出现假阳性结果， 检测率达到99%。Derisi J（1996）等选用来自恶性肿瘤细胞系UACC903中的1161个cDNA克隆制成芯片，通过比较正常和肿瘤细胞的表达差异 ，发现在恶性肿瘤细胞中P21基因处于失活或关闭状态，但在逆转的细胞系中呈高表达 ［10］ 。1997年Affymetrit公司和Oncormed公司合作研制的可监测50%以上肿瘤患者P53基因突变的P53基因芯 片将在癌症早期的诊断中发挥作用 ［11］ ，同年新的芯片问世，能同时监测250种和癌相关的基因。Lopez等 ［12］ 已运用DNA基因芯片检测肿瘤细胞中K-ras基因的突变。1998年底，上海细胞生物研究所的胡赓熙博士所在的课题组开始了c DNA阵列的制备和应用技术研究，到1999年6月，已经成功地建立了含有8000个不同人类基因的cDNA阵列，该cDNA阵 列已经被成功地应用于肝癌的研究，它的研制成功，标志着我国已经有了自行设计生产基因芯片并加以实际应用的能力。

3.4 在白血病和淋巴瘤检测中的应用 Golub（1999）等应用cDNA芯片检测基因表达的差异进行癌症的分类，成功地区分出急性髓细胞性白血病（AML）和急性 淋巴细胞性白血病（ALL），预期这种方法还能诊断出新的白血病种类 ［13］ 。弥漫性大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）是非何杰金淋巴瘤的一种亚型，在临床上有明显的异质性。Alizadeh等 ［14］ 利用基因芯片技术将DLBCL分成两类，一类为原始中心B细胞样DLBCL，另一类为激活的B细胞样DLBCL它们有不同的基因 表达谱，反应不同的细胞发育阶段。前者有较好的疗效和预后，而后者较差。

3.5 其它 基因芯片技术还可以检测白血病，已有成型的芯片用于诊断β-地中海贫血，并在β-珠蛋白研究上检测出了3个突变位点;也可用于遗 传病相关基因的定位检测，如肥胖病，老年痴呆，精神病等。在基因突变与多态性的检测、新基因的识别、药物安全性评价、细胞凋亡、 等位基因的多态性分析等诸多方面均有相应的研究。

4 存在的问题及展望

基因芯片短期内难以在临床上广泛应用的原因有以下几点:（1）目前对人体基因功能还知之甚少，基因芯片的优势难以得到发挥，能通 过基因芯片进行诊治的疾病目前还处于初始阶段，只能应用于一些分子机理相对清楚的疾病。（2）通过基因芯片技术检测耐药基因对临 床进行用药指导，但目前还没有建立起庞大的耐药基因库。（3）芯片技术使用的目是DNA或RNA，要求标本用量大，用于临床须与 PCR技术相结合，但基因芯片的高通量对于多重PCR有一 定的难度，目前虽有解决办法，但操作繁琐，成本较高。（4）分子生物学技术比较繁琐，只有通过高集成化样品制备、基因扩增、核酸 标记及检测仪器的研制和开发才能实现简单化、自动化，使其在临床上得到广泛应用。（5）作为一项全新的实验室技术，质量控制体系 有待建立和完善。（6）目前基因芯片的价格太高，不利于临床上的广泛应用。但该技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对 样品的需求量非常少，效率高，能同时分析数千种作为遗传、基因组研究或诊断用的DNA序列，更好地解释基因之间表达的相互关系及 检测基因表达变化的灵敏度高等优点。基因芯片在医学上的应用前景是非常广泛的，1999年Nature Genetics杂志出版了增刊，指出了基因芯片的发展方向:（1）提高探针阵列的集成度。（2）提高检测的灵敏度。（3）研制 新的应用芯片。（4）研制芯片意大利读器（检测系统）和分析软件，以充分利用生物信息。（5）方法的标准化和降低成本。综上所述 ，基因芯片的先进性勿庸置疑，它将给检验医学带来一场深刻的革命，但是实现基因诊断需要一个过程，它需要我们每个人的努力。目前 世界各国科学家们正努力创造更完善的芯片技术，相信不久的将来会有更可观的前景。

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