[转帖]自动化免疫血液分析仪的使用前确认

——康凤凤、胡丽涛、王治国

【摘要】 目的 探讨行自动化免疫血液分析仪使用前的确认。方法 参照CLSI I/LA33-A及相关文件，结合临床实验室的实际情况进行分析总结。结果 临床实验室在使用自动化免疫血液分析仪之前必须进行确认，包括安装确认、运行确认和性能确认。结论 只有当实验室确认自动化免疫血液系统的性能满足厂商的声明后，才能用于常规检测。
【关键词】 自动化系统；免疫血液学检测；性能确认

免疫血液学检测包括血液定型、红细胞同种抗体检测、红细胞抗体鉴定试验、交叉配血和直接抗球蛋白试验（DAT）。其中血型定型又包括了常见的ABO血型测定、Rh血型定型、弱D抗原检测及其他红细胞表面抗原检测。随着检测技术的发展，目前已经建立几种体外检测红细胞抗原抗体反应的自动化系统。自动化系统应用各种方法检测抗原抗体反应，包括溶血凝集反应和固相柱凝集反应。出现凝集表示反应性或阳性结果。孵育步骤可提供足够的时间用于抗原抗体反应。抗原抗体反应检测完后，自动化系统记录终末点并解释检测结果。自动化免疫血液分析仪使用前的确认流程包括建立确认要求、风险评估、确认计划、程序培训、安装确认、性能确认、文件、最终审核和结论及运用自动分析系统。实验室应严格按照确认过程的各个步骤依次进行确认，确认过程中的项活动都应有相应的文件记录。

一、确认的要求
确认活动、任务和项目的选择应与自动化系统的复杂性或功能及其用于特定预期用途功能相关的风险相对应。对于较低风险的部分，仅需执行最低的确认活动。对于风险较高的部分应该增加额外的确认活动。

二、风险评估
风险评估包括如下部分：自动化系统过程中的关键控制点，软件中关于数据完整性、真实性和保密性的关键控制点；自动化系统产生的产品安全、有效性及质量相关的风险；可能出现的对病人、献血者、员工或实验室的危害。风险评估的系统途径包括如下几个步骤：识别潜在的风险，追溯风险至触发条件、事件或原因，收集分析信息，划分风险的等级（如1-3为低级，4-6为中等，7-9为高级），消除风险或者降低风险 。

三、确认计划
在全面了解自动化系统后，应制定合理的确认计划，计划包括以下几个部分。

1 实验室和厂家信息。具体包括：实验室名称、地址、电话号码及传真号码，实验室联系人的姓名、e-mail地址和电话号码，仪器厂家的名称、地址、电话号码及传真号码，厂家联系人的姓名、e-mail地址和电话号码。

2 确认计划的标题应该包含自动分析系统的名称。

3 确认的目的。具体包括如下内容：声明确认计划的完成将证明自动化系统能持续产生符合实验室要求的结果，支持自动化系统的方针、过程和程序，声明确认的原因。

4 自动化系统的描述。应包括以下几点：系统概述，预期用途，厂家支持的检测项目列表，技术规范，设备序列号，硬件版本，软件版本，试剂、稀释液及配件的列表及用户手册。

5 实验室与厂家应确定自动化系统安装过程中的责任。如果由实验室安装系统，应从厂家中获得生厂商说明书和程序，保证系统合理安装及之后的预期运行。如果由厂家代表来安装系统，应从厂家获得安装、检查及任何证明合理安装和运行的检测结果的文件。

6 确认过程包括安装确认IQ、运行确认OQ和性能确认PQ。

7 厂家提供的方案。厂家提供的确认方案可帮助实验室建立自动化系统的确认计划，但是不能替代实验室内部的确认计划。对大多数实验室，厂家提供的IQ/OQ检测项目或方案足以满足要求。但在执行这些案例前必须对其进行审核，保证满足所有的实验室要求。

8 自动化系统的局限性。确认计划应明确系统的局限性，描述异常情况的处理方法，如下所示：重复的标本识别码（条形码），标本、卡、板、条带、试剂瓶等上条形码的缺失或无法读取（如磨损、漏贴、破坏），条形码读取失败，不合格的标本（时限、凝块、抗凝剂、气泡、纤维蛋白、量少、脂血、溶血、黄疸），非预期结果，日期编辑，试剂或稀释液放置错误，多重错误信息，标本、试剂、稀释液和洗涤液量不够，使用过期产品：试剂、稀释液、卡、条带，未进行质控或质控结果不可接受的检测结果，其他注意事项（如紧急、熟练程度、微量）。

9 确认计划中应建立具体的可接受标准。明确确认计划的各组成部分（IQ、OQ和PQ）的可接受标准以评估确认总体成功与否。根据预期结果，在确认计划执行前建立确定每个检测项目的可接受标准。

10 时间安排
确认计划应明确时间表。表1列出了常见的任务及推荐持续时间。时间表可因各实验室而异。建立时间表后，还需考虑平行试验的自动化系统和标本、标本时间要求、人力资源（执行文件审核的人员）、厂家资源、休假和工作流程安排、需要的其他部门资源（如信息技术员）。

表1确认计划时间表

11 立合理的审查和批准步骤。需要审核和批准项目如下：确认计划本身（执行前），IQ的结果，OQ的结果，PQ的结果，每个检测项目的结果，不符合的报告，最终的确认报告。

四、程序
确认过程中涉及到的程序包括两个方面，一方面是仪器确认本身的程序，另一方面是每个检测项目的操作程序。每个实验室应建立相应的程序对确认计划的实施过程进行说明。这些程序 通常视为质量体系的一部分，也指质量管理过程。遵守这些程序是免疫血液学检测的自动化系统确认的重要组成部分。检测项目的操作程序主要是涉及编写或修改实验室SOP文件和相应的表格。

五、培训
应对参加确认过程的人员进行相关的培训。培训活动通常由厂家组织，实验室派出仪器的主要使用者和负责人参加培训。培训计划应提供如下内容：确认过程，仪器操作，实验室工作流程，如何使自动化系统在实验室工作流程中有效运行，质量体系特别是质量控制，执行确认时仪器的维护保养，检测项目及条件，文件记录。培训计划应记录以下内容：培训教练责任，接受培训者责任，培训指南，培训计划，初步能力核对表，直接观察核对表，书面评价。

六、安装确认（IQ）
1 目的
通过安装验证来证明自动化系统正确安装。IQ是一系列证实自动化系统组件已齐全并在实验室环境下正确安装的正式检查和文件记录。安装者应记录系统安装过程中的所有活动。IQ应考虑以下几点：安装确认、诊断报告、LIS/BECS信息交流、自动化系统的设置、访问权限设置、常规保养验证、校准、安全性能、设备的环境要求（足够的空间和电力）、软件按位置要求合理设置、安全和隐私要求、外部数据接口交流要求及影响检测结果的关键因素。

2 环境条件
验证自动化系统安装的环境条件应符合最低要求。安装前实验室应与厂家讨论环境要求，因为改变实验室的环境要求相对困难。应确认以下常见的环境因素：温、湿度范围，电力、光线要求，废品处理设备，物理空间，用户权限及液体资源。

3 LIS/ BECS主机交流
如果自动化系统计划与LIS/BCES交流，则必须验证并记录两者之间的联系。

4 系统设置
检查所有的系统设置是否符合实验室的需要。常规设置包括：可进行哪些标本和质控物检测、结果输出的形式、条形码符号和不同的用户权限。

5 菜单
验证并记录自动化系统获得的检测菜单以证明其符合实验室的期望。如果检测定义在系统的多个区域，应审查每个区域验证所有期望的检测项目都已列出。

6 质量控制
验证所有需要的质控试验和程序是否存在。理解自动化系统及标本检测的质量控制方法很重要。特定的自动化系统可能要求独立于检检测验的质控检测和程序。另外，质控程序的数目和类型取决于设置的检测菜单。这些程序可能以完全自动化的形式由自动化系统执行和解读，且需在运行前执行。质控程序也可能是半自动或手工处理，意味着操作者负责运行并标明结果为合格或失败。通过审查产品标签或与厂家交流，明确自动化系统上的检测组合所需QC检测。验证存在合理的质控检测和手工质控操作的正确说明。

7 用户权限
自动化系统的安装应包括用户权限的设置，可通过不同方式实现。权限设置基于不同的访问水平，实验室应明确每个水平的访问权限。在OQ中应建立每个水平的用户账户并进行验证。

8 常规保养验证
通常由厂家提供一系列保养活动，实验室需对其进行验证。

七、运行确认（OQ）
1 目的
OQ是证明自动化系统能按照厂家说明进行运行，保证系统能按照厂家预期的在合适的条件下满足用户所有的要求。

2 核对内容
以下内容应得到验证：所有条形码扫描器对病人/献血者标本、试剂的读取，试剂、稀释液、凝胶卡、微孔板的装载和卸载，试剂、凝胶卡和微孔板的过期标签，可获得的试剂报告，校准，质量控制检测，手工输入标本识别号，结果的数据审核，手工更改检测结果，不符合结果的处理，结果的评价的位置，警告和错误代码，安全限制，预防性保养说明，包括标本结果等数据的输入或输出的接口，试剂仓温度，过程控制限制及采取的活动。

3 管理
自动化系统包括管理用户权限的软件。设置访问密码可以保证只有授权人员能进行安全的或者密码保护的活动。实验室应委派一名软件管理员。系统管理确认应包括对每个用户的权限进行重复检测的步骤。实验室应验证系统管理员能进行以下活动：管理员登入，访问先前创建用户ID相关的权限列表，设置注销时间，更改用户功能，删除用户功能，访问软件的限制区验证检测设置、QC标准和报告模式。

4 用户功能和访问
实验室应确认密码保护的用户功能按定义执行：密码保护的功能提示用户输入密码，用户输入密码后能执行相应功能，无权限的用户不能进行受限的功能，密码保护的功能对所有用户开放，终止访问的用户不能再访问此系统，访问拒绝时显示错误信息。

5 实验室信息服务接口的确认
自动化系统能通过单向或双向接口与LIS/BECS进行交流。确认应包括相应的文件和程序，保证病人或捐献者信息在自动化系统和LIS/BECS之间的传输是正确和安全的。

6 标本/试剂污染
污染可由携带污染或飞溅造成。携带污染是由于标本针暴露于前一标本或试剂中。如果系统有专用的传输系统，可不必评价携带污染。如果同一个探针用于所有的试剂或标本，则可能产生携带污染。根据自动化系统的设置，携带污染可能不局限于前一个标本和试剂。咨询厂家明确携带污染的可能机制是很重要的。标本或试剂的飞溅也能导致污染。这种事件发生的可能性依赖于自动化系统的设计、正确安装和使用。当考虑是否存在污染及其原因时，可评估自动化系统的设计或咨询厂家。

实验室进行自动化系统的携带污染的评价可包括：ABO定型，检测A型标本，紧接检测B型标本或O型标本，再检测AB型标本；Rh定型，检测Rh阳性标本，紧接检测Rh阴性标本；抗体检测，检测高效价抗体，紧接检测已知阴性的标本。如果检测到携带污染，应与厂家协商以确定恰当的措施。

八、性能确认（PQ）
1 目的
PQ是证实自动化系统能根据实验室、法规和认证机构的要求在正常运行条件下产生可接受结果并符合生产商的声明。用常规标本和非常规标本检测自动化系统的性能。

2 标本选择
特殊检测项目的标本应代表实验室计划在自动化系统上检测的标本。通常采用先前检测过的病人或献血者的标本用于系统确认。应规定标本类型和数目，例如当评价AB0/Rh定型时，AB型、D阴性的标本数目可能有限，因此验证这种血型所需的标本数目可较其他血型的标本数少。每个检测项目中应包括阳性和阴性标本，如当评价抗体检测时，应包括由比较方法检出的阳性和阴性结果。

3 标本采集
标本采集时必须使用用户手册上列出的抗凝剂并评价使用各种抗凝剂得到的结果。标本采集后的最大时间应根据自动化系统和试剂生产商的说明及实验室具体情况而定。如果试剂说明书和自动化系统用户手册中对于标本类型、时间限制或其他标本相关的标准不同，应以自动化系统说明为准。有些自动化系统允许采用非系统配套的试剂，标本类型、时间限制或标本相关的标准可能同试剂说明书和用户手册上描述的不同，以自动化系统生产商的说明书为准。

4 弱反应性标本和检出限附近标本的重复性
验证自动化系统正确解释弱反应性标本的能力是很重要的。因为弱反应性标本在普通人群中并不流行，更应着重检测这类标本。通过重复检测检出限附近的弱反应性标本来评价其性能。使用自动化系统显示为弱阳性的标本，如评价定型试验时选用抗原弱表达的RBC，评价筛查试验时选用包含弱抗体的血浆等。有些自动化系统可能不分等级，仅提供阳性或阴性的解释。这种情况下，使用其他方法确定弱反应性标本。

弱反应性标本在普通人群中不常见，应在平时保留这些标本。根据这些检测标本的可获得性，可能需要汇集标本或通过使用强阳性标本手工获得弱阳性标本。

检测弱阳性标本时，应建立详细的程序和可接受标准。因为这些标本在检出限附近反应，其结果更易受变量的影响。现没有权威的免疫血液学检测校准模式。没有一个单独的方法或自动化系统能检测所有的抗原抗体反应，建立可接受标准时应考虑到这点。

5 ABO/Rh定型
检测包括由比较方法确定的代表每种血型（ABO和Rh）的标本。检测项目中每种血型的标本数目可能受限于实验室标本的可获得性或稀有血型的获得能力（如B阴性、AB阴性）。

6 抗体
最常见的临床上有意义的抗体包括：抗-D、-E、-e、-C、-c、-K、-Fya、-Fyb、-Jka、-Jkb及-S。如果实验室可获得代表不同抗体特异性的阳性标本，可用于自动化系统的抗体检测和鉴定的确认。如果可能的话，阳性标本应表现不同的反应强度。当验证抗体检检测验时，保证不同反应强度的充足的标本比各个血型系统抗体的一个标本更重要。选择抗体时应确保阳性和阴性反应的RRBC的不同组合。如果自动化系统用于抗体鉴定，应选择代表不同抗体特异性的标本，特别是自动化系统解释RRBC谱细胞反应。实验室对每种抗体特异性标本的数目不是固定。如果可能的话，应将重点放在选择不同反应强度的标本上。

临床上没有意义的抗体通常包括抗-Lea、-Leb、-P1、-N及冷自身抗体（如自身抗-I或自身抗-HI）。加入含这些抗体的标本可帮助用户更好地理解自动化系统的检测局限性及性能特征。稀有抗体通常是针对高频抗原，如抗-U、抗-k和抗-Lub。实验室偶尔遇见的其他抗体通常需要参考实验室专门检测进行权威鉴定，包括Knops/McCoy、Chido/Rodgers、Dombrock血型系统的抗体。因为包含这些抗体的血清不易获得，检测这些抗体的确认也没有必要。

7 红细胞抗原
如果实验室选择的自动化系统是对病人或献血者的抗原进行分型，则应通过批准的抗血清且适用特定系统的方法学。如果实验室选择未通过批准的抗血清方法学进行预先筛查，以帮助发现某些高频抗原（如c/e型）阴性的献血者，则应进行严格的检测，阴性结果应通过批准方法进行确认。除非这种类型的检测在用户手册上有特殊说明，实验室应意识到自身承担这类检测结果的全部责任。

8 干扰物质
根据实验室标本接受标准，应评价含干扰物质的不同标本。标本特性（如严重溶血或浑浊血浆）可能会干扰自动化系统的阅读设备，限制反应的正确解释。在这种情况下，自动化系统应警告用户审查反应通道或结果，决定是否能进行人工解释或用另一不同的方法重复检测。如果可能的话，实验室可选择严重黄疸、溶血和或浑浊（高甘油三酯）的标本来验证自动化系统能发出警报（见CLSI EP07）。

9 基质效应
标本基质的理化影响如粘度、表面张力、浑浊度、离子强度及PH是基质效应常见的原因。病人标本可因治疗方案包含未知的干扰物质。冰冻血清标本可能通过改变结合蛋白产生基质效应。考虑基质的理化因素对自动化系统准确测定标本结果的影响（如干扰）（见CLSI文件EP14）。用于性能确认的标本应通过厂家批准。

10 应进行PQ的常见的检测项目
ABO和Rh定型：包括每种血型（A/B/O/AB）和D阳性及阴性的标本，ABO正定型和反定型不一致的标本，如果可能，包括弱D或部分D标本。

抗体检测和鉴定：包括有和无同种抗体的标本，阳性标本包括各种不同抗体特异性证明不同的血型系统的性能，检测不同强度和类型（IgG/IgM）的抗体。
DAT：阳性和阴性标本（多特异性、IgG及C3）。
抗原定型：包括有和无目的抗原的标本，直接和间接（AHG）定型技术。
交叉配型：包括匹配和不匹配供血者/受血者标本的多种组合，质疑实验室和自动化系统应用的方法。

11 方法比对
评价自动化系统的性能时，标本由需确认的方法和比对方法同时进行检测。比对方法有时也称比较法，是实验室已建立的已知能产生可接受水平的性能的检测方法。如果当前使用的方法有局限性，可选择另外的方法作为比对。这种情况下，替代方法应是实验室明确岂能很好的运行和解释。规划检测程序和可接受标准时，应考虑将使用的比对方法及两种方法可能出现的差异。如果两种方法在血清学上是等同的，唯一的区别就是自动与手动，那么预期一致度将会很高。如果两种方法在血清学上有差异，那么任一方法的局限性所致的差异将有可能出现。在这种情况下，最好考虑采取另一种额外的比较方法帮助确定不符合解释的真实结果。

12 重复性研究
检测性能应进行批间和批内重复性试验。重复性试验应有代表性，包括代表不同类型的标本和试验可能出现的反应。重复性研究包括不同反应等级的标本，多次检测比较结果的解释。如果同时确认多个相同的自动化系统时，还应考虑仪器间的再现性。重复性研究中也可包括多个仪器间的直接比较。

13 可接受标准
通常系统的性能是通过比较检测系统和比对方法之间结果的一致度来评价的。因为血液免疫学检测的没有行业接受参考标准，结果比对后不能用于计算灵敏度或特异性值，但是可以计算一致百分数，包括阳性一致度（PPA）、阴性一致度（NPA）及总体一致百分数。应注意计算的一致百分数仅两方法真实一致度的估计。这种估计值反应真实一致度的可信度可用统计学方法进行评价。

实验室应明确检测项目确认的可接受性要求的一致百分数，注意以下几点。系统设计已由厂家或第三方进行确认。重复同等水平的确认试验证明在统计学显著水平的高度一致（>99%）是不合理也不必要的。查阅行业期刊、摘要及其他文献明确是否有关于此自动化系统的研究。通常，获得发表的文献能帮助实验室建立合理可行的接受标准。查阅所有合适实验室的好的规则和标准，确保可接受标准在要求的水平支持自动化系统的性能。

14 不符合结果
PQ过程中可能会出现不一致结果，规划可接受性标准中应描述不符合结果的可接受数目，这可通过测定两种方法间最低的一致性水平实现。

对调查试验中遇到的不符合结果，以更好地理解差异产生的原因。结果不符合可归于各种因素。某些潜在的原因如下。
检测系统的已知局限性：检测系统和比对方法之间的已知的局限性差异都可引起不符合结果。应审查两者的局限性明确不一致结果是否属于这类原因。

与检测方法无关，标本的不同反应性：标本呈现与检测方法无关的不同的反应性可能是造成两种方法差异的原因。同时通过同时用两种方法对不符合标本进行重复检测，如果检测结果不同于任一方法，表明不符合是因为标本的特殊性，而不是两种方法之间的差异。

试剂或标本的不正确处理或准备：审查每个不符合结果的实验准备和步骤，明确不一致是否归因于不正确的步骤，而不是检测方法之间的差异。

检测项目中固有的错误：如果检测项目编写不正确，那么按照编写执行的检测不可能得到预期的结果。当怀疑这个原因时应查阅实验室程序手册或用户手册。

自动化系统或试剂性能：仪器或试剂可能不按说明运行。这种情况下，应通知厂家。

15 差异的排除标准
如果不符合的原因与检测方法无关，那么这种不符合应排除在一致度计算之外，但应保留这些可解释的不一致的数目和原因的信息，供日后审查。不符合研究包括不符合标本的重复检测，明确重复试验后的结果是否一致。如果重复试验结果一致时，初始不符合结果的信息也不应删去。一致度数据不应仅表现为重复后的结果，初始不不符结果应也保留。如果标准规则中不包括重复所有检测结果，则确认过程中的重复性结果不能用于性能评估。

当比对方法不是参考方法时应谨慎。因为非参考方法的结果并不总是正确，其任何性能局限性都可能导致出现不符合。如果没有额外的信息，这些不符合将纳入一致度计算中。这种情况下，最好使用参考方法检测这些不符合。参考方法的结果能明确哪种方法的结果是正确的。这种分析能明确尽管检测方法和非参考标准比对方法的一致度比预期的低，但是检测方法与参考方法所得的不符合比与非参考方法的不符合低的情况。这象征检测方法优于比对方法。当规划可接受标准中使用非标准参考方法时应考虑这种情况，避免因为检测方法性能优于比对方法而导致的确认失败。

16 统计学分析
检测方法和比对方法之间的计算一致百分数（一致结果数/总结果数）不能视为两种方法间的真实一致度。因为PQ过程检测的标本数目有限，计算一致度仅是真实一致度的点估计，应使用统计学方法明确计算一致百分数与真实一致度的关系，获得一个可能包含真实一致度范围，此范围称为置信区间（CI）。
性能检测的目的是验证方法满足生产商关于检测体系和比对方法间的一致度的声明，CI下限和可信度水平是目的参数。CI的上限是没有意义的，因为当真实一致度高于上限时是可接受的，这表示真实一致度比估计的更高。所以，采用的CI的可信度水平低于真实一致度值大于上限所需要的可信度水平。

九、文件
确认过程中的每个任务都应有文件记录。确认计划应明确将记录什么结果。这些文件在应在执行过程中完成。确认计划中的文件应按照过程将三个确认部分（IQ/OQ/PQ）作为自动化系统最初的确认。结果可表示在模板上作为检测项目的特定任务的一部分。当仅针对某个功能的一个性能时这种类型的文件对IQ/OQ检测项目是很有用的。这种情况下，在任务旁边做上简单的检查标志就足够了。PQ通常需要重复进行检测项目。在这种情况下，结果应记录在一种单独类型的数据表上，后者可以观察多重结果。确认文件包括形成的报告、截屏、内部确认计划、总结、不符合报告和相关支持性文件应根据合理的监管和认证要求进行修改，当检查时可提供证据证明确认活动已执行且充分广泛和可接受。

当得到的结果与预期的结果不符合时都应有不符合报告。不符合报告可在以下情况出现：检测项目未通过可接受标准；执行检测项目时未遵循用户手册或SOP；LIS/BECS或自动化系统未通过规范。所有的不符合结果应予以解决或解释。不符合报告应表明其原因时自动化系统运行固有的还是其他因素。在这种情况下，确认小组或管理者应决定是否进行重复检测来消除其他因素的影响。

十、结论和最终审查
此部分应提供所有检测项目的确认总结。结论部分至少应陈述IQ、OQ和PQ已完成，自动化系统已通过批准，同时还应包括相关数据分析及其统计学和临床意义的总结。此部分可能还包括对不期望结果和方法偏差进行高水平的描述、评判和解决。结论中还应包括：可获得自动化系统的用户操作文件，自动化系统的功用和环境要求已符合，系统组成部分包括软件，已根据用户手册和安装说明进行安装，日保养、周保养和月保养成功执行质控标本检测成功，完成的检测项目的列表和简单描述，PQ中每个部分检测的标本数的总结。一旦确认总结和相关文件通过审查，负责人员或部门同意确认的可接受性，则可签订最终的报告并按照法规和实验室要求储存。