microRNA

2000年，RNA的研究进展被美国《科学》杂志评为重大科技突破；2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”；2002年12月20日，科学杂志将“小 RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时， 自然杂志亦将小 RNA评为年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划）相提并论的最重大成果之一。

近年来，RNA已经逐步摆脱了DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。随着RNAi技术在生命领域的应用，RNAi的主要作用物siRNA对研究人员来说已经非常熟悉。而同属于小分子RNA的microRNA（简称miRNA）则与RNAi和siRNA有着莫大的关联，但是miRNA和siRNA又有着多方面的差异。

研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，而且研究人员推测这种小分子调节着人类三分之一的基因！最新的研究结果表明：miRNA还与病毒的复制有关; 淋巴瘤中，miRNA的一类miR17-92可能是潜在的致癌基因，并且发现一种叫做c-Myc的转录因子能调节miRNA； miRNA还是干细胞不断分裂必须的；而另一项研究发现了miRNA在心脏形成过程中是重要的靶标。另有研究表明miRNA还与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等病变有关。

miRNA到底是谁？你知道miRNA与siRNA的区别在哪里以及如何区别它们吗？它与RNAi有着什么样的关系呢？ miRNA与疾病、生长发育有着什么样的关系？有关它的最新研究进展如何？

因本刊很多读者对此并无深入研究，因此我们从DNA到RNA, 直至最新发现的miRNA一步一步说起：
一、什么是DNA?

1.1 DNA的定义
DNA是一种长链聚合物，90%以上分布于细胞核，其余分布于核外，如线粒体、叶绿体、质粒等。DNA携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型。DNA组成单位称为脱氧核苷酸（即 A-腺嘌呤G-鸟嘌呤C-胞嘧啶T-胸腺嘧啶），而糖类与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相接，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，是蛋白质氨基酸序列合成的依据。读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条为模板复制出一段称为RNA的核酸分子。多数RNA带有合成蛋白质的讯息，另有一些本身就拥有特殊功能，例如rRNA、snRNA与siRNA。

在细胞内，DNA能组织成染色体结构，整组染色体则统称为基因组。染色体在细胞分裂之前会先行复制，此过程称为DNA复制。对真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体是存放于细胞核内；对于原核生物而言，如细菌，则是存放在细胞质中的类核里。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。

1.2 DNA的结构
目前一般划分为一级结构、二级结构、三级结构、四级结构四个阶段。

DNA的一级结构（见图1）是指构成核酸的四种基本组成单位——脱氧核糖核苷酸（核苷酸），通过3’,5’－磷酸二酯键彼此连接起来的线形多聚体，以及其基本单位－脱氧核糖核苷酸的排列顺序。每一种脱氧核糖核苷酸由三个部分所组成：一分子含氮碱基+一分子五碳糖(脱氧核糖)+一分子磷酸根。核酸的含氮碱基又可分为四类：腺嘌呤（adenine，缩写为A），胸腺嘧啶（thymine，缩写为T），胞嘧啶（cytosine，缩写为C）和鸟嘌呤（guanine，缩写为G）。DNA的四种含氮碱基组成具有物种特异性。即四种含氮碱基的比例在同物种不同个体间是一致的，但在不同物种间则有差异。

图1、DNA的一级结构

DNA的二级结构是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。DNA的二级结构分为两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA等；另一类是左手双螺旋，如Z-DNA。詹姆斯?沃森与佛朗西斯?克里克所发现的双螺旋，是称为B型的水结合型DNA，在细胞中最为常见(如图2)。也有的DNA为单链，一般见于原核生物，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。有的DNA为环形，有的DNA为线形。在碱A与T之间可以形成两个氢键，G 与C之间可以形成三个氢键，使两条多聚脱氧核苷酸形成互补的双链，由于组成碱基对的两个碱基的分布不在一个平面上，氢键使碱基对沿长轴旋转一定角度，使碱基的形状像螺旋桨叶片的样子，整个DNA分子形成双螺旋缠绕状。

DNA的三级结构（见图3）是指DNA中单链与双链、双链之间的相互作用形成的三链或四链结构。如H-DNA或R-环等三级结构。DNA的三级结构是指DNA进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构，也称为超螺旋结构。DNA的超螺旋结构可分为正、负超螺旋两大类，并可互相转变。超螺旋是克服张力而形成的。当DNA双螺旋分子在溶液中以一定构象自由存在时，双螺旋处于能量最低状态此为松弛态。如果使这种正常的DNA分子额外地多转几圈或少转几圈，就使双螺旋产生张力，如果DNA分子两端是开放的，这种张力可通过链的转动而释放出来，DNA就恢复到正常的双螺旋状态。但如果DNA分子两端是固定的，或者是环状分子，这种张力就不能通过链的旋转释放掉，只能使DNA分子本身发生扭曲，以此抵消张力，这就形成超螺旋，是双螺旋的螺旋。

图3
核酸以反式作用存在（如核糖体、剪接体），这可看作是核酸的四级水平的结构。

二、什么是RNA？

2.1 RNA（见图4）的定义
RNA（ribonucleic acid）是核酸的一类，分布于胞核、胞液，普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。

RNA是由核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的多聚体。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

图4、RNA

2.2 RNA分类
根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）, rRNA（核糖体RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
　　
在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。
　　
1982年以来，研究表明，不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶（ribozyme）。
　　
20世纪90年代以来，又发现了RNAi（RNA interference，RNA干扰）等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。

2.3 RNA的生物功能
20世纪40年代，人们从细胞化学和紫外光细胞光谱法观察到凡是RNA含量丰富的组织中蛋白质的含量也较多,就推测RNA和蛋白质生物合成有关。RNA参与蛋白质生物合成过程核糖核酸的有3类：转移核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖体核糖核酸(rRNA)。 不同的RNA有着不同的功能其中rRNA是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而mRNA、tRNA在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。
　　
mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。
　　
tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质。

2.4 RNA的结构
RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。

【RNA的二级结构】细胞内有三类主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它们各有特点。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5～8倍。

三、DNA与RNA的相互关系

3.1 生物的遗传信息
生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA(messengerRNA，mRNA)。

3.2 mRNA的功能
就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）。

3.3 tRNA
如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA——转移RNA(图5)

图5、tRNA

（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40种以上。
　　
tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均约为27000（25000 - 30000），由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点，稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后，经过特殊的修饰而成的。
　
3.4 snRNA
除了上述几种主要的RNA外，细胞内还有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。
　　
上述各种RNA分子均为转录的产物，mRNA最后翻译为蛋白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。

四、什么是microRNA?

4.1 microRNAs的定义
microRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码短序列RNA，其大小长约20~25个核苷酸。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。

microRNAs本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5＇端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

4.2 microRNA的发现与生物起源

1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA（lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3’UTR区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。7年后科学家又发现了第二个miRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。

自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了成千的miRNAs。被鉴定的miRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。

miRNAs起源于内源性表达转录本，是长约21-25nt的双链RNA分子，其典型特征是具有发卡结构。miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（PrimarymiRNA）转录本（第1步）；这个70－100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（Precursor miRNA，)（第2步）；之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质（第3步），接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的miRNA（第4步）；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-Induced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补并列（第5-6步）；miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA要不在翻译水平被部分抑制，要不完全断裂（第7步）。植物体中，断裂似乎是主要的工作方式，而哺乳动物中则以翻译水平的抑制为主要方式。

4.3 microRNA命名法
鉴于microRNA数量庞大，在人类中有几百个，在其他物种有几千个，已经采用了一个命名体系，在发表其发现前为特定microRNAs指定名称。实验确认microRNAs的名称是前缀mir加上破折号加上数字，例如mir-123。

小写mir-指前-miRNA，大写miR-指成熟形态。如果两个miRNAs在1或2核苷酸有相同的结构条，用附加的小写字母表示其相似结构，例如miR-1a和 miR-1b。

不同位点的miRNAs可能产生相同的miRNA，它们用附加数字表示，例如miR-1-1和miR-1-2。严格来说，microRNA命名应在前面注上其所在物种，例如homo sapiens = hsa-miR-xxx。

其他常见miRNAs物种包括病毒v-mirNA 和 drosphila d-miRNA.。microRNAs如果从3’末端或5’末端开始，则加上-3p或 5p后缀例如miR-142-5p，miR-142-3p。

4.4 miRNA的作用方式
miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类；第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3′端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。

4.5 miRNA的特异性
研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。miRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

4.6 miRNA的验证及靶基因研究
随着lin-4、let-7等miRNA基因的发现，已经有大量的miRNA为科研工作者们发现，近年来，更是随着生物信息学的不断进步，利用计算机的强大力量，通过其预测发现了更多的miRNA，但是对于这些预测的结果还必须要通过实验的验证才能为事实所接受，而这将是一项浩大的工程。

随着在这一方面的研究的不断的深入，目前，对于miRNA的验证方法主要包括以下几种办法：
1.测序：克隆和测序可以为miRNA的验证提供了最高水平验证；其中序列特异性的克隆和测序（Sequence-specific cloning and sequencing）是近年来发现的一种新的方法；
2.杂交：不同的杂交方法可以对miRNA的验证提供重要的间接验证。其中Northern一直被认为是金标准的方法，但在敏感性及特异性方面有一定的限制。其他的方法还有RNase保护试验和信号放大核酶法（signal-amplifying ribozyme method）；
3.高通量的方法：其原理也是依靠杂交，包括膜芯片（便宜，但在检测多种miRNA时不够敏感）、microarray(利用放射性检测的办法可以有效、敏感、特异性地验证miRNA)、Bead-based profiling（一种新的检测microRNA表达的方法，比传统的microarray要更便宜）。

五、miRNA研究与疾病及研究进展

5.1 miRNA与爱滋病毒
2001年，科学家发现一小段RNA可以关闭线虫体内的基因，这与早前发现的一些RNA小片段能使植物基因处于关闭状态的基因抑制现象十分相似；随后，又在老鼠和人的体细胞中发现了类似的RNA干扰现象。分子生物学家们认识到，这种RNA干扰对研究基因功能可能有非常重要的价值。

2002年针对RNA的进一步研究表明，一些长度较短的小RNA能够对细胞和基因的很多行为进行控制，如打开、关闭多种基因，降解一些不需要的信使RNA。其中最令人兴奋的发现是，小RNA在细胞分裂过程中也能发挥重要的控制作用，可以指导个体的发育和分化。

继发现长度较短的核糖核酸能调控基因表达之后，2003年科学家们继续专注于小RNA如何协调细胞习性的研究，正在探索如何利用小核糖核酸的本领来对付疾病。有关专家指出，这一领域的研究发现可以为操作干细胞分化提供新工具，并且可以用于探索治疗癌症等由于基因组错误所导致的疾病的新方法。

目前认为miRNA在人体中有200多种类型。研究表明miRNA与感染的病毒的复制有关——之前认为这种分子只与内生的物质的调节有关，而于外源病毒的调节无关。因此，这一发现对miRNA的功能有了新的认识。

5.2 miRNA与癌症
miRNA的活动模式能够被用于诊断癌症。研究人员Todd R. Golub和Robert Horvitz等人证明miRNA表达特征能用于划分人类癌症以及区别正常细胞和癌细胞。研究表明miRNA表达特征甚至能够鉴别出那些从外形上无法确定的癌细胞。由霍普金斯大学医学院的Joshua Mendell和同事的研究显示一些miRNA与一种已知能导致人类癌症的基因相互协作。这让人怀疑miRNA可能充当一种新型的癌基因。通过确定出大多数常见癌症中表达的特殊miRNA以及分析它们对癌症发生和癌症基因的影响。

5.2.1 microRNA 功能的研究方法
近来，几乎所有与miRNA 相关的肿瘤研究都是以癌细胞和正常细胞中不同的miRNA 表达图谱为依据。因此，用于探测miRNA 表达的方法同样也能运用于癌症中miRNA 功能的研究。

5.2.1.1 上调或下调miRNA 的表达
上调或下调候选miRNA 的表达是研究癌症发病机理中miRNA 功能的好方法。特定miRNA 的敲除或过表达可用于研究miRNA 在癌症发生和发展过程中的作用。反义抑制、转基因、特异性启动子调控、点突变等方法能实现这方面的研究。利用反义抑制剂阻碍目标miRNA 的功能就是一个很好的例子。在这一策略中,人造反义RNA 与细胞中的mRNA 竞争结合到miRNA 上，抑制miRNA 的功能。两个独立的研究小组采用这种方法均实现了序列特异性地抑制miRNA 和siRNA 诱导的RNA 沉默，此外Krutzfeldt 等利用修饰的反义RNA 在体内成功地抑制了4 个miRNA。

miRNA 或其靶基因的点突变同样能用于癌症中miRNA 功能的研究， 其优势在于它能够用于研究miRNA 与其靶基因之间的直接相互作用。许多研究发现“种子序列”对于miRNA 识别靶基因很重要， 并且增加种子序列中的错配将会大大地减少miRNA 的基因调控功能。因此，可以运用这种策略来设计miRNA 或其靶基因的点突变， 即某一特定候选miRNA 的种子序列中1个或2个核苷酸的改变将会极大地减少miRNA 与其靶基因结合的可能性，进而导致此miRNA 靶基因的过表达。

5.2.1.2 Northern 杂交
Northern 杂交是在RNA 水平上探测基因表达的一种可靠技术，它广泛地应用于基因表达分析领域。目前，该技术也被用于探测癌细胞中miRNA 表达。例如，通过正常细胞与癌细胞中miRNA 表达的比较，Hayashita 等发现miR-17-92 基因簇在肺癌患者体内过量表达。

5.2.1.3 实时PCR（Real-time PCR）
实时PCR 用于定量分析miRNA 表达图谱及研究癌症发病机理中miRNA 可能存在的一些功能。近年来，有人用Real-time PCR 测定miRNA 前体及研究6 个细胞系中23个miRNA 前体的表达。最近，Real-time PCR 的应用范围已经扩展到人类癌细胞系中222 个miRNA 前体的表达分析。研究表明，人类癌症中miRNA 前体的表达图谱确实存在差异。因此，Real-time PCR 技术是研究癌症中miRNA表达水平，进而研究其功能的理想方法。

5.2.1.4 microRNA 微阵列
miRNA 微阵列（microRNA microarray）是一种能同时探测癌细胞中大量miRNA 表达的方法。它被广泛地用于研究miRNA 在癌症发生中的作用， 同时已经成为帮助我们更好地理解癌组织与正常组织之间关系的一种综合性的技术。例如一些实验室采用一种双泳道miRNA 微阵列技术对124个哺乳动物miRNA 的表达水平进行分析，发现miRNA 的表达模式在成年小鼠的组织和胚胎干细胞中是不同的。Lu 等运用微阵列技术在不同类型的细胞中探测到了丰富的miRNA 表达图谱。

5.2.2 microRNA 与肿瘤发生
最近研究表明，microRNA 能够作为肿瘤抑制剂或致癌因子行使功能，因此与癌症相关的miRNA也被称为oncogenic miRNAs（oncomiRs）。Calin 等证实miR-15 和miR-16 位于染色体13q14 （B-细胞型慢性淋巴性白血病B-CLL 的缺失位点）上，首次将microRNAs 与癌症联系起来。Bottoni 等发现，miR-15a 和miR-16-1 在垂体瘤中的表达水平比正常垂体组织低。而且，它们的表达与肿瘤直径及精氨酰-tRNA 合成酶表达成负相关，但却与p43 分泌正相关，从而说明这些miRNAs 很可能影响肿瘤的生长。此外，Cimmino 等还证实了miR-15a 和miR-16-1 的表达与Bcl2 在CLL 中的表达成负相关，miRNA 对Bcl2 的抑制作用诱导了细胞凋亡。因此，miR-15a 和miR-16-1 是天然的反义Bcl2 作用因子。O’Donnell 等报道来自miR-17-92 簇的miRNA能够调控肿瘤形成， 其通过影响E2F1 mRNA 的翻译来行使类似抑癌基因的功能。Welch 等发现，miR-34a 通过抑制其靶mRNA 翻译E2F3，降低E2F3 蛋白水平，对成神经细胞瘤的发生起抑制作用。深入探讨miRNA 对肿瘤发生的调控机制，对于将来进行肿瘤的临床诊断、分型、治疗及预后判断具有重要意义。

5.2.3 microRNA 与肿瘤诊断
Lu 等根据基于微珠流式细胞术建立的miRNA表达图谱，针对人类癌症样本，包括直肠癌、肝癌、胰腺癌以及胃癌，提出了一种关于microRNA 的系统表达分析， 显示了miRNA 图谱在癌症诊断中的发展潜力。通过微点阵和RT-PCR 的方法分析垂体瘤和正常垂体样本中的miRNA 组（miRNAome），Bottoni 等指出miRNA 表达能够区分微腺瘤与大腺瘤， 处理过的患者样本与未处理样本。许多miRNAs 参与了细胞增殖和细胞凋亡过程。miRNAs将很可能成为非常有用的诊断标记，同时还能改进垂体瘤的分类。通过原位RT-PCR 的应用，Lee 等在胰腺癌细胞中发现表达异常的miR-221、miR-301 和miR-376a，而在基质、正常的腺泡或腺管中却未能找到它们。miRNA 的异常表达为胰腺肿瘤的研究提供了新的线索，同时也可能会给胰腺癌的诊断提供生物标记。目前，尽管miRNA 有助于临床肿瘤的诊断，但是距离真正应用于临床仍有很大距离，仍需大量临床病例资料的系统研究。

5.2.4 microRNA 与肿瘤预后
利用人恶性肿瘤中oncomiRs 的表达图谱鉴定出了许多癌症诊断和预测相关的信号。Takamizawa等报道了人肺癌中let-7 miRNA 的表达率下降，且减少的miRNA 表达与更低的术后存活率十分相关。此外，A549 肺腺癌细胞系中let-7 的过分表达抑制了体内肺癌细胞生长。他们的研究表明let-7miRNA 的改变具有潜在的临床和生物学作用。Yanaihara 等证实miRNA 表达图谱能够将发生癌变的肺组织与正常肺组织区分开来，同时在研究中发现不同于肿瘤组织学中的分子信号。另外，研究还发现hsa-miR-155 前体miRNA 高表达和hsa-let-7a-2 前体miRNA 低表达与肺腺癌的低存活率相关，说明miRNA 表达图谱不仅是诊断标记，同时也是肺癌的预后标记。

5.2.5 microRNA 与肿瘤治疗
miRNAs 参与癌症发生和发展过程给新型抗癌症药物的开发带来了希望。目前，许多能够直接影响致癌基因产物的新药物、小分子和单克隆抗体已经制得，更多类似的产品将会继续研制。根据miRNA与其靶基因的互补性，一些人造miRNAs（artificial miRNAs，amiRNAs）相继制得，它们能够下调致癌基因并抑制癌症的形成。He 等发现，在转基因小鼠体内表达mir-17-92 能够有效抑制c-myc 诱导的细胞凋亡，从而加快肿瘤形成。由于大多数致癌基因能够引发癌症，因而可以设计一些人造miRNA阻碍其表达，从而达到抑制癌症形成的目的。尽管目前在肿瘤治疗方面已取得了一些成绩，但仍面临许多难题。首先，只有鉴定出某种癌症中特定miRNA 及其在该癌症发生过程中的作用机理，才能将这些miRNAs 运用到癌症治疗当中。如何将这些特定的miRNAs 转移到目的组织上并保证其正常行使功能是随之而来的另一难题。

新的研究表明miRNA在从癌症、心脏病到艾滋病的各种疾病中起到一定的作用，而且有间接的证据表明如果将两个miRNA从人类基因组中删除就会发生白血病。据推测，MiRNA能够调节人类的三分之一的基因。有研究表明miRNA能够调节Ras癌基因、干细胞分化、脊椎动物肢体的形成等。

托马斯?杰斐逊大学杰斐逊医学院和Kimmel癌症中心的研究人员在PNAS上公布说，他们开发出了一种能用于在癌症和正常组织中寻找发生表达的miRNA以及表达方式的技术。他们开发出的miRNA芯片能够使他们检测到每种组织特有的miRNA表达模式，根据miRNA基因的表达模式来预测白血病。

可以肯定，miRNA并非身体中的“超高级智能”分子，它虽然主要是作为调节性因子而存在，但它也必然是受到其他“暗物质”的调节。已经有研究发现一种叫做c-Myc的转录因子能调节miRNA。对miRNA的基础研究以及应用研究还在不断的向着纵深发展，我们期待有更多新的研究成果不断涌现并最终能促进人类健康事业的发展。

六、最新研究进展

6.1 miRNA为临床寻找乳腺癌高危女性提供参考
复旦大学附属肿瘤医院、复旦大学乳腺癌研究所的最新研究深入探讨了乳腺癌干细胞相关微小RNA（microRNA）let-7，与肿瘤恶性转化相关基因LIN28形成的LIN28/let-7双向负反馈调控环的基因变异在乳腺癌发生中的作用。研究首次揭示了LIN28的3’非翻译区多态位点参与LIN28/let-7反馈环的生物学调控，调节LIN28和let-7的基因表达；尤为重要的是，多态效应通过双向负反馈环得到级联扩增。该项成果为临床寻找乳腺癌高危女性提供了参考，也为let-7这一乳腺癌“干性”调控microRNA在生理条件下如何影响LIN28/let-7环的基因差异表达提供了遗传学基础。

该研究由邵志敏教授领衔的乳腺癌易感性研究课题组完成。课题组立足于中国人群乳腺癌和正常对照的DNA及组织样本，系统分析了中国人群的基因突变和基因变异，取得了如BRCA1/2突变在中国家族性、早发性乳腺癌中的流行病情况，p53基因的变异热点和功能学改变，以及散发性乳腺癌中雌醌代谢酶基因多态性对乳腺癌发生的作用等一系列研究成果。本次针对LIN28/let-7环遗传变异的研究，是对散发性乳腺癌遗传易感性研究的有力补充，提示microRNA相关多态在乳腺癌发生发展中的地位。当前，乳腺癌高危人群筛查、肿瘤风险预测成为乳腺癌预防中的重要任务，本成果为寻找乳腺癌特异性预测位点提供了临床前基础。项目获得国家自然科学基金委的资助。

6.2解析miRNA与系统性狼疮疾病
来自中科院上海生命科学研究院，香港大学等处的研究人员发现了系统性红斑狼疮的新易感基因miR-146a，这是首次鉴定出miRNA分子启动子区域与狼疮疾病发生中发挥重要作用的SNP，对于今后发展miRNA为靶点的干预治疗具有重要意义。这一研究成果公布在PloS Genetics杂志上。

领导这一研究的是沈南教授，其早年毕业于上海第二医科大学，现任上海风湿病学研究所副所长，分子遗传学研究室主任，上海第二医科大学附属仁济医院风湿病学科副主任，教授。文章的第一作者是罗晓兵博士，这项研究工作得到了国家科技部973计划、863计划、国家自然科学基金委和上海市科委项目的支持。

系统性红斑狼疮是一种具有极强遗传倾向的系统性自身免疫病，I型干扰素通路过度活化是其重要的分子表型。microRNA（miRNA）在维持免疫系统稳态中发挥重要作用。沈南教授研究组前期研究发现，miRNA表达或者功能的异常与自身免疫性疾病的发生和发展有关，系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者存在miR-146a表达缺陷，引起I型干扰素通路过度活化，进而参与红斑狼疮疾病的发生发展。

最近，该课题组罗晓兵博士在沈南教授的指导下，找到了miR-146a参与狼疮发病的分子遗传学证据，并发表了题为“A Functional Variant in MicroRNA-146a Promoter Modulates Its Expression and Confers Disease Risk for Systemic Lupus Erythematosus”的研究论文。

该项研究采用候选基因测序的策略，选择大样本的病例-对照研究方法，在多个人群中发现miR-146a启动子区域存在一个重要的SNP与SLE显著相关。携带疾病相关等位基因的个体，其miR-146a基因表达水平显著低于对照组。体外功能研究亦证实，此疾病相关SNP不同的基因型与已被报道的狼疮易感基因ETS1编码表达的蛋白转录因子结合能力不同，增加或者降低ETS-1表达水平可导致miR-146a启动子活性的改变。遗传学分析也证实，ETS1与miR-146a可相互影响，在狼疮发病中发挥叠加效应。

该项研究首次鉴定出miRNA分子启动子区域与狼疮疾病发生中发挥重要作用的SNP，同时也例证了复杂性疾病中多个易感基因通过相互作用从而共同参与疾病的发生。

6.3 一新miRNA影响干细胞分化
来自德州农工(A&M)大学（Texas A&M University），华盛顿大学等处的研究人员发现一种小RNA：miR166/165能影响参与分裂组织细胞发育的一种基因，从而影响干细胞分化。这一研究成果公布在《细胞》（Cell）杂志上，也是《细胞》杂志倍受关注的一篇论文。

文章的通讯作者是德州农工大学生物化学与生物物理学助理教授的张修仁（Xiuren Zhang，音译）博士，其研究组主要方向是小RNA剪接与病毒抑制研究。

miRNA是一类动植物细胞内自然产生的非编码小RNA，自从1993年在线虫中发现了首个miRNA以来，miRNA被发现参与调节了众多的细胞功能与发育过程。这一小分子连续几年被国际分子生物学顶级杂志评为“十大科技突破之一”，也成为遗传、发育、癌症、干细胞等多个领域中的研究新热点。时至今日，已有约1000个动物的miRNA被报道，且约30%的基因被预测为miRNA的靶基因，能够被miRNA所直接调控。

在这篇文章中，研究人员发现一种小RNA分子能与一种模式植物拟南芥中参与分裂组织细胞发育的基因：AGO10相互作用，AGO10基因(也称为PINHEAD (PNH)或ZWILLE (ZLL))是拟南芥调控顶端分生组织的重要因子。

研究人员发现AGO10能够特异的和miR165/166结合，最终促进了HD-ZIPⅢ（HD-ZIPⅢ是调控拟南芥顶端分生组织的重要转录因子）的表达。当miR166/165不与AGO10结合，或者AGO10基因缺失的时候，植物的分裂组织会被破坏。而当miR166/165与其它AGO蛋白结合时，植物则会停止相关基因的表达。

这些研究成果说明miR166/165与其它基因结合会阻碍分裂细胞的正常发育，而与AGO10结合可以阻止该MiRNA与其它基因作用，并且研究人员发现AGO10与miR165/166的相互作用依赖于miR165/166的结构且与AGO10的催化活性无关。这阐述了干细胞形成果实、种子和叶子的一种分化机理，对于进一步分析miRNA对干细胞分化的影响具有重要意义。

近期还有科学研究表明，miRNA分子可抑制退行性眼病中的血管异常生长，这一研究发现为老年性黄斑变性的治疗提供了新策略。

研究人员发现两个miRNA分子与退行性眼病中的血管异常形成密切相关。当两个miRNA基因簇成员miR-23 和miR-27发生功能沉默时可抑制眼脉络膜血管生成。机体通常通过维持生长因子和抑制因子的作用平衡而对正常组织中的血管生成进行调控。当这一过程发生失衡时，血管异常生成可导致多种疾病发生。过去科学家们将对退行性眼病的治疗研究集中在抑制血管内皮生长因子(VEGF)上。研究人员通过在患者研究中注入抗VEGF药物的方法来改善患者的视力。然而这些药物在治疗某些新生血管性黄斑病变中疗效有限，并伴有潜在的副作用。

6.4 使用microRNAs对纤维原细胞重编程得到诱导多能干细胞
美国科学家首次用实验鼠的微小RNA（microRNAs）对很容易从皮肤活检中得到的纤维原细胞进行重新编程，制造出了诱导多能干细胞（iPSCs）。科学家可据此制造出特定病人的iPS细胞，以用于药物筛选和身体组织再生。相关研究发表在《细胞—干细胞》杂志上。

负责该研究的美国宾夕法尼亚大学医学院医学、细胞和发育生物学教授兼再生医学研究所科学主管爱德华?莫里西表示，这是科学家首次未使用4个转录因子制造出iPS细胞，并将效率提高了100倍。

2006年，日本科学家山中申弥利用病毒载体将4个转录因子的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到了一种类似胚胎干细胞的细胞类型，这就是iPS细胞。随后很多科学家陆续报告称，他们使用这4个转录因子上的变异制造出了iPS细胞。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等方面的障碍，因此，其应用前景非常广阔。

从事该研究的科学家希望，有朝一日能有效制造出不同病人的干细胞以研究人类疾病；制造出一个细胞“仓库”以让人体自身的心脏、肝脏等细胞再生。尽管前景诱人，但制造出iPS细胞还面临着效率低的问题，使用人体细胞制造iPS细胞的效率尤其低下。另外，添加新基因等方法可能有导致癌症的副作用，因此，提高iPS细胞的转化效率和安全性成为近年来科学界的研究重点之一。

以前，科学家使用转录因子让成人细胞重新编程，每使用10万个成人细胞得到的iPS细胞不足20个。而新实验中，科学家使用微小RNA来让成人细胞重新编程，结果，每使用10万个成人细胞得到的iPS细胞高达1万多个。

莫里西表示，这种方法能制造出iPS细胞让他们很吃惊，而且，其效率比山中申弥首次提出的转录因子方法高很多。至于为何在制造iPS细胞的过程中，微小RNA和4个转录因子的作用原理如此不同还需进一步的研究。

莫里西实验室研发的微小RNA方法产生的iPS细胞能制造出老鼠体内几乎全部的组织，包括生殖细胞、精子和卵子等。该科研团队目前正同其他科学团队合作，试图将这些诱导多能干细胞分化成心肌细胞、造血细胞和肝脏细胞。

莫里西表示，在用病人的样本制造iPS细胞的过程中，这种方法不仅效率高，而且可以得到更多产品。他们希望制造出人工合成的微小RNA，来将成人细胞转变为iPS细胞，最终得到包括肝脏、心肌或神经细胞等在内的各种细胞。

美国心肺和血液研究所的肺病研究室主管詹姆斯?基莱认为，有效制造出诱导多能干细胞对其治疗用途至关重要，新方法朝科学家的最终目标前进了一大步，也将促进其他干细胞研究的发展。

6.5 miRNA-193a抑癌功能研究获进展
3月14日，国际知名杂志《致癌基因》（Oncogene）发表了中国人民解放军总医院血液科和基础医学研究所的一篇研究性文章，在文章中研究人员利用microRNA-193a在急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）中抑制了c-kit表达，证实其可发挥重要的肿瘤抑制子功能。

领导这一研究的是中国人民解放军总医院血液科主任医师于力教授，其从事血液科临床工作20余年，在血液系统疑难病症的诊断、白血病和淋巴瘤的治疗及造血干细胞移植等方面具有丰富的临床经验，主要研究方向为血液系统恶性肿瘤的诊断、治疗及造血干细胞移植。于力教授曾在国际上首次发现两个白血病相关基因LRP15和LRP16，并在国际基因库中注册。他还在国际上首次证明ID4基因具有抑制白血病细胞增长的功能，这一研究成果发表在国际著名杂志《自然遗传学》（Nature Genetics）上。

原癌基因c-kit是一种III型酪氨酸激酶受体，广泛地表达于肥大细胞、黑色素细胞、造血干细胞、肠间质细胞和生殖细胞中。大量的研究证实多种恶性肿瘤如急性骨髓性白血病细胞中存在c-kit的异常激活，与癌症的发生、增生、浸润和转移密切相关。近年来有一些研究表明肿瘤通过表观遗传学修饰沉默肿瘤抑制性microRNAs (miRNAs)从而导致了原癌基因激活。

在这篇文章中，中国人民解放军总医院的研究人员利用荧光报告分析方法在急性骨髓性白血病中筛查了几种有可能与人类c-kit mRNA的3′UTR区结合的miRNAs。在急性骨髓性白血病细胞和原发性AML芽细胞中研究人员发现内嵌在c-kit mRNA CpG岛上的miR-193a序列发生了超甲基化。进而，研究人员在9种白血病细胞系和27名原发性AML患者血液样品中证实miR-193a水平与c-kit水平呈现负相关。

在进一步的研究中，科研人员利用合成miR-193a转染和DNA低甲基化试剂5-氮胞苷(5-aza)处理等方法证实，在c-kit 突变和C-kit过表达的AML细胞中恢复miR-193a可显著降低c-kit的RNA和蛋白质水平，并抑制细胞生长。当研究人员在细胞中加入miR-193a抑制剂时，发现其部分地阻断了5-aza诱导的c-kit抑制，逆转了5-aza的抗增殖以及促凋亡效应。这些数据表明甲基化抑制miR-193a在急性髓细胞样白血病的发病过程中发挥了关键性的作用。

新研究发现使研究人员更深入地了解了急性髓细胞样白血病的发病机理，并为c-kit阳性的AML的治疗指明了新的有潜力的治疗靶点。

6.6 蛋白质和microRNA抑制肿瘤的细胞转移
乳腺癌肿瘤干细胞在乳腺癌疾病的扩散与进展方面起着关键作用。近期，美德州大学MD安德森癌症中心的科学家认为，对活跃的p53基因为攻击乳腺肿瘤干细胞提供了潜在路径。

长期以来，研究者认为p53基因可控制DNA损伤、缺陷的细胞自我凋亡，并能激活RNA。这能防止分布在器官上的上皮分化细胞，转化为类似于间充质干细胞-受TGF-B(beta)刺激的细胞。

间充质细胞是移动的成体干细胞，能自我繁殖，并分化为各种细胞类型。MD安德森癌症中心分子细胞肿瘤系的教授谈到：防止上皮细胞向间充质细胞转化在癌症转移方面发挥了重要作用。

6.7 癌症治疗的希望
我们发现p53激活micro RNA miR-200c，使具有干细胞特性的细胞恢复到上皮细胞的形式。这一方法可对具有干细胞特性的肿瘤起始细胞产生治疗功能。

研究表明大约80%的各类实体瘤开始于上皮细胞。然而，90%的癌症死亡率源于癌症转移并扩散到身体的其他器官。

上皮细胞间质转型（EMT）及其逆向过程在胚胎发展过程中发挥重要作用。研究者将EMT激活与癌症的发展与转移相联系。最近的研究将EMT与在正常和转化细胞中干细胞特性的获取相联系。

6.8 细胞状态依赖于p53, miR-200c 水平。
一系列的实验表明p53蛋白质激活miR-200c，产生microRNA，蛋白质和miR-200c的表达上下起伏。

P53基因突变发生在一半以上的肿瘤上，p53基因的失活与癌症相关类型中的糟糕的病症相关。通过miR-200c的重新表达，恢复p53基因突变丧失的功能可能是治疗p53缺陷肿瘤不错的治疗方案。该研究发表于Nature Cell Biology杂志上。

6.9 microRNA-199表达高低与肝癌患者预后密切相关
最新一期《癌细胞》Cancer Cell 杂志发表了中国工程院院士、医学免疫学国家重点实验室主任曹雪涛课题组及其合作者的研究论文，报道了其通过深度测序技术进行人正常肝脏、病毒性肝炎肝脏、肝硬化肝脏和人肝癌microRNA组学分析，发现了microRNA-199表达高低与肝癌患者预后密切相关，证明microRNA-199能够靶向抑制促肝癌激酶分子PAK4而显著抑制肝癌生长，从而为肝癌的预防判断与生物治疗提供了新的潜在靶标。

肝癌对我国人民健康危害很大，特别是对于晚期肝癌患者，目前尚缺乏有效的治疗手段，因此，对肝癌发生发展分子机制的研究并结合肝癌患者临床资料寻找新的预后判断标志物与治疗靶标具有重要意义。

microRNA与多种疾病包括癌症的发生发展机制的研究是近年来生物医学界的前沿热点课题。为了探求在肝癌发生发展过程中哪些microRNA可能发挥了重要作用，曹雪涛课题组与清华大学医学院、浙江大学免疫所、上海东方肝胆外科医院、上海长征医院、复旦大学中山医院、广西肿瘤医院、中山大学生命科学院、华大基因、国家疾病控制中心等单位联合攻关，先通过深度测序技术首次获得了人正常肝脏、病毒性肝炎肝脏、肝硬化肝脏和人肝癌组织的microRNA组数据，了解到肝癌与正常肝脏microRNA的差别，通过4个独立的肝癌患者临床队列分析，发现人正常肝脏高丰度表达的microRNA-199在人肝癌中普遍性显著降低，并且microRNA-199的低表达与肝癌患者的生存期降低显著相关。进一步发现肝癌组织中组蛋白甲基化改变导致了microRNA-199表达降低，microRNA-199能够靶向抑制PAK4进而抑制下游的ERK信号通路，从而抑制了肝癌细胞的生长。通过肝靶向性腺相关病毒载体介导的microRNA-199基因治疗，显著延长了肝癌裸鼠生存期。由此证明microRNA-199是肝癌预防判断与治疗新的潜在靶标，为肝癌生物治疗提出了新方法。

该工作是面向我国重大疾病防治需求和医学界目前普遍重视的转化医学研究，在国家“十一五”重大专项以及国家自然基金委资助下，集基础研究、生物技术与临床标本和病人资料分析等多家单位和学科交叉合作的成果。有关专家认为，该工作揭示的正常与疾病肝脏microRNA组数据为后期进一步研究microRNA在肝脏生理和肝脏疾病中的作用奠定了基础。

6.10 MiR-429有助治疗卵巢癌
卵巢癌往往到晚期才被发现，而等到发现时，癌细胞已经转移到其他器官，难以通过化疗等方法治疗。美国最新研究发现，一种microRNA可以有效对抗卵巢癌，这一发现将使医生有可能采用传统的化疗方法治疗卵巢癌。

美国佐治亚理工学院的研究人员在美国新一期《妇科肿瘤学》杂志上报告说，他们在实验中利用具有调控功能的miRNA－429，使卵巢癌细胞转变成不能转移的状态，从而使癌细胞无法扩散。

负责这项研究的约翰?麦克唐纳指出，这一发现将使医生有可能将病人的癌细胞生命周期调回到可以采用传统的化疗方法治疗的阶段。

七、 展望

我国对于RNA的研究曾经一度处于世界先进水平。在上世纪60年代，生物学领域刚刚开始了解核糖核酸的结构和功能，我们就进行了对RNA的研究。在1981年，我国出色地完成了一种小分子RNA———酵母丙氨酸tRNA的全合成，并且这种人工合成的RNA分子具有生物活性、完成了全部的碱基修饰，其产率和活性是世界上最高的。目前在RNA研究领域，国内一些实验室的工作也十分出色，研究水平是国际一流的。但是就目前整体情况来看，国内对RNA的研究的重视度还不够。虽然我国对于RNA的研究在某些方面曾领先世界，但目前总体来说还是十分薄弱的，希望通过本篇文章能使广大有志从事RNA研究的同仁明确研究方向，从长远来看，miRNA必将在医疗领域大放异彩，尤其是肿瘤早期预防和诊断方面，如果本文能使年轻有为的博学人才从事miRNA的研究，那我们就非常高兴了。

拜读了，好