[转帖]遗传病分子诊断方法的质量控制——胡丽涛 王治国

[摘要]
目的 阐述遗传病分子诊断方法的质量控制和方法确认。
方法 主要参考美国临床和实验室标准化研究院（CLSI）MM1-A2文件相关内容，并结合具体的实际进行总结。
结果 遗传病分子诊断方法的质量保证涉及到多个环节并且有其特殊性，分子诊断方法在使用之前应经过合理的程序进行确认。
结论 分子诊断在遗传病的诊断方面起着十分重要的作用，实验室应该做好全面的质量控制，以保证结果的准确可靠。

[关键词] 遗传病；分子诊断试验；聚合酶链反应；质量控制；方法确认

一、分析前质量控制

1. 信息登记
1.1家族史和临床数据
考虑到遗传病的分子诊断范围和复杂性，信息登记对于实验室来说非常重要。遗传病分子检测在携带者筛查、症状前诊断和产前诊断方面有较大差异，集中了大量罕见疾病，连锁分析需要临床信息以及产前诊断的检测周转时间，因此实验室需要经常与临床医师沟通。实验室在解释结果时应参考检测申请的相关信息，同时也应该考虑家族史和准确的遗传家谱图。检测报告单上应该出现必要的信息，并与临床医师沟通，同时注意保护患者的隐私。

1.2知情同意
遗传病检测有复杂的社会心理和经济风险。推荐在采集标本做检测前取得患者的知情同意，其内容包括检测的目的（鉴别诊断或者预测性诊断）、待检疾病/基因的特性、所用检测程序（已发展成熟或者是研究性的）、所用检测方法的性能、检测对象是成人还是儿童、专业机构的指南等。

对于某些遗传病的检测，实验室需要有文件记录标本分析前的知情同意。很多实验室都意识到了基因预测和症状前的检测会造成很大的社会心理负担或不可逆转的临床干预。因此临床医师，而不是实验室，有责任根据相关的法律法规获得知情同意。获得知情同意之后，应该用通俗易懂的语言向受试者说明检测的相关情况，包括检测的风险和受益，检测的性能特性，根据结果接下来可能采取的措施以及阳性或阴性结果可能带来的不利结局。

2. 标本标识和验收
2.1标本类型
应用扩增技术可以处理极微量的样品，理论上，遗传病的分子检测标本可以是人体任何有核细胞。遗传病分子诊断实验室标本的组织来源和类型取决于特定的疾病，但更多的取决于临床需要解决的问题。例如，携带者和症状前诊断通常需要采集血液或者口腔标本，然而产前诊断需要的是羊水或者绒毛标本。这些检测若使用Southern印迹杂交则需要数毫升的血液或者经培养的羊水细胞，若采用PCR技术则标本可以是小的干血斑、口腔脱落细胞或者未经培养的羊水细胞。对于某些只能通过连锁分析才能诊断的疾病则需要其他的受影响或未受影响的家庭成员包括父母或胎儿的标本。

2.2标本标识
标本容器应该有清晰的标明患者唯一的标识，如患者编号。在多数情况下只有患者名字是不够的，患者名字与出生年月相结合总体上足以预防身份标识错误，标本容器还应标明标本采集的日期和时间。此外，在标识患者的同时还应该保护患者的隐私。当然，保护患者隐私这一规定的目的不是阻止直接涉及患者诊治的医务人员间足够的信息分享。

2.3申请单
所有的标本都应该附有一个申请单，尽可能的包含以下内容：患者姓名、出生日期、采集日期、性别、种族、容器上的唯一的患者身份标识、标本类型、申请检测的理由、系谱图（连锁分析需要，对于所有病例都推荐）、申请医师和记账信息（如适用）。

2.4拒收标本的标准
推荐每个实验室应有书面的标本的接受和拒收标准。若标本或者申请单缺乏足够的信息供实验室或者临床医师唯一识别该标本，或其它必要的信息以决定标本或者检测申请是否适当，这一类的标本应该拒收。同时，处理或运送不当的标本也有理由拒收。

其它标本接受或者拒收的情况由实验室自行决定。由于基因扩增技术非常强大，要规定标本最小的细胞含量或者体积有一定的困难，但是推荐每个实验室建立各自的标准。推荐产前诊断标本，特别是绒毛标本应该用PCR基因型分析技术评价母体细胞污染。

2.5 标本验收
每一个标本都应该有唯一的标识。这一标识应该将患者/家属标识与其他标识结合起来。例如，实验室用于单个电泳或者印记的标识。这一独特的标识不仅要区分来自不同患者的标本，还应该区分来自同一患者的不同标本，和来自同一家庭的不同成员。应依法保护患者隐私，同时也应该为专业人员提供足够的信息进行诊断和治疗。

2.6标本运送和保存
基因扩增只需少量的非严格保存的细胞，细胞可以是活的、死的或者部分降解的，因此此类标本的运送和保存要求都不是很严格。此外，标本可以是羊水、干血斑和石蜡包被组织，无法制定统一的标准。每个实验室应该根据在各类标本中成功提取合格DNA的经验制定各类标本的标准。通常冰冻组织应该用干冰运输，新鲜组织应该用湿冰运输，固定的或者干燥的组织应该在室温运输。羊水标本应该用适合细胞培养的媒介中运输。用于核酸提取的非冰冻新鲜组织液血液应该避免长期保存。冰冻组织可在-70℃下无期限保存。实验室可根据经验将固定或者干燥标本在室温下保存特定时间。

2.7核酸保存
分离得到的DNA和RNA应该用密闭容器保存。在-20℃或者-70℃长期保存以防止降解。DNA样品可在4℃密闭容器内保存数月，其稳定性不变。若超过保存期限应对样品的整体性进行重新评估。

2.8标本保留
所有病理标本和分子基因标本，特别是含有DNA的标本的保留期限不仅有法医学方面的考虑，而且对家族研究和后裔的研究也非常重要。需要证明所保留的患者DNA 的质量足以用于是连锁研究或直接突变鉴定，甚至是一些尚未建立的检测。标本保留主要涉及到伦理和法律问题，如标本的所有权，保密和知情同意。在没有普通的推荐规定和用于实施的法规之前，实验室应该建立各自的标本的保留和使用政策。

二、分析中质量控制

1. 检测确认和特征描述
在将检测用于临床工作之前应该对方法进行分析确认和临床确认。此外，实验室还需要熟悉检测的临床使用。参照临床分子实验室ACMG标准和指南的确认条款和最新版的CLSI EP15进行确认。临床确认可能要通过评审，通常超出了实验室的能力范围。此外，检测还应该遵循：（1）进行文献评审，即使实验室进行了内部临床确认研究。（2）进行分析的和实验室/临床相关研究，以描述待检位点或突变的特征；建立检测的性能属性确保检测能够提供一致可靠的结果；建立检测的临床用途（如本项目可为诊断某一疾病或受试个人或家庭成员基因状态提供一定的帮助）；确定检测程序以保障检测性能；确定检测的局限性。必须进行以上确认内容以保障基因检测安全有效。

1.1 受检靶位点/等位基因/突变的特征描述
一般，疾病状态与特殊突变的相关性应该有文献报道，除罕见障碍例外每一个疾病至少有3个不同的研究者对其诊断用途进行了确认。应该记录从临床和家庭对所有基因检测的临床用途的看法。

靶基因的选择应该合理。每一个受检的靶位点/等位基因/突变的特征应该进行详细描述，并在科学文献中有记录。特征描述包括以下内容：
（1）靶位点在人类基因组学图谱、Geneatlas、GenBank、基因组数据库 (GDB)或基因国际人类细胞遗传学术语命名法（ISCN）中的位置。
（2）缺陷类型、等位基因突变类型和被检靶核酸序列等。
（3）靶位点的多态性属性和保守程度，若存在关联，核查SNP数据库确定变异。
（4）检测的目标人群；确定疾病在不同人群中的患病率和检测针对目标人群的灵敏度。
（5）疾病人群分布、缺失频率、突变率和不同亚群中任何已知的频率 分布差异（如地理、种族和民族）。
（6）临床疾病解释的遗传基础和相关机制，包括家庭研究确认的遗传方式、遗传异质性、外显率减少、变异表达、以及基因、环境等其他改变因素的延迟发作和引起疾病的其他异常现象（如单亲二倍体、铭印、微卫星/三联体扩展、镶嵌或线粒体基础）。

1.2 方法/程序确认
方法确认应该包括以下内容：
（1）确定需要严格控制和监测的重要环节。
（2）证实方法学在检测可疑靶基因方面的应用，包括适当的同行评议参考文献。
（3）建立获得可靠结果需要的最小组织或标本的量。
（4）确认分析过程、质量控制、设备和仪器的每个环节。
（5）确保关键反应物的特性（如酶、探针和引物），包括探针引物的大小和类型、限制性酶谱、碱基序列和识别位点；探针标记的标记物、标记方式、结合稳定性；引物或探针的多重功效；参考序列在GenBank中的参考编号；反应物设计的基本原理（引物和探针）；反应物的特异性、生产和质量控制，如探针的合成、克隆载体、载体大小、插入比例、分离、纯化、连接、最佳浓度和功能确认；接受标准。

1.3 评估试验的性能属性
应该研究检测的分析和临床性能属性并记录。研究内容包括设置定量的目标性能、使用统计学程序分析并定量重要的变异来源（如对于组织标本检测的确认应考虑固定剂的影响）检测性能数据必须有程序在临床常规诊断性实验室正确操作的置信度。由于错误的基因诊断可能会有不利的后果，因此需要设置分析性能和准确解释结果的标准。可接受的性能特征取决于特殊的检测应用（如筛查试验、诊断/确诊试验）。可接受性能的确定要具体分析。特殊检测可能有检测危险家庭成员的检测性能特征，但不适用于广泛的人群，反之亦然。

1.3.1 分析性能
确定关键的分析性能属性并进行特征描述，至少包括分析灵敏度、特异性、稳健性和检测精密度或复现性。应该对可能用于检测的所有标本类型进行确认，并记录来自同一个体的可能产生相同结果的不同标本类型（满足标本可接受标准）。使用已知的、特征明确的标本评价程序，包括推荐的和极度的运输保存条件下的标本。应该使用已知的或纯化的靶DNA进行分析性能的特征描述。之后，适当调整参数使程序最优化并用临床标本或质控物重新评估。

1.3.2 诊断性能
用适当的方法建立检测用于预期目的和人群的诊断性能。分子遗传病的诊断性能指的是试验能够正确测量和预测目标诊断终点的能力，如临床结局（表现型）和基因状态（基因型）。新的分子诊断方法应该针对同一疾病的现有诊断方法进行比较。新的方法的性能只有与现有方法相当或优于现有方法才能使用（如可操作性好、缩短了周转时间或节约了成本）。对于遗传性检测通常没有可比较方法。如果是这种情况，应该对新方法进行评估确定其测定或预测一个可识别的诊断终点的能力。

（1）建立检测用于每一项相关目的基因状态的预期值、截断值或终点和检测区分疾病状态的检测阈值。实验室可从文献或专业机构制定的指南中获得相关信息。例如，脆性X染色体综合征分析，可使用ACMG标准和指南建立区分正常、突变前和完全突变的三联体扩展大小。

（2）诊断灵敏度和特异性。经合理设计的方法比对和临床试验对于建立检测的诊断性能十分重要。患病率较低、外显率减低、变异表达、发病延迟、遗传异质性或其它罕见特征的疾病对应的研究设计相对较难。诊断敏感性和特异性研究需要有足够多的受试者，预测值及置信限可以适当估计人群流行范围。所设计的研究方法应避免引入偏倚，制定合适的受试者选择方案（纳入/排除标准、随机），相关或无关个体的纳入应该仔细考虑。遇到低患病率的疾病或者从检测到发病有一段较长时间的疾病，可能不便于评价适于目标人群的诊断性能，推荐使用症状明显的受试者合理的大概估计测试的灵敏度，使用易感者或超过疾病发病年龄尚未受到影响的人来评价测试的特异性。结果解释应该考虑估计偏倚。产前诊断的确认试验是胎儿是否患有某种疾病，主要通过产前诊断结果的随访。前瞻性研究（取得知情同意和审查委员会授权）是较好的研究设计，但是研究者应该注意到其中的伦理问题。

表1和2展示了用于计算诊断灵敏度和特异性的方法以及如何确定估计值的置信限。
表1 阳性和阴性受试者的检测结果

 

表2 95%的置信区间估计

（3）预测值。阳性预测值（PV+）和阴性预测值（PV-）是评价检测对目标人群的有效性，尤其是对于广泛人群的筛查价值。预测值是疾病患病率与诊断灵敏度和特异度的一个函数。为了合理估计预测值，灵敏度和特异度的估计必须足够准确。发病频率未知疾病的预测值估计有一定的困难。
阳性预测值（PV+）=P（D+|T+）=1-假阳性率
假阳性率=

阴性预测值（P-）=P（D-|T-）=1-假阴性率
假阳性率=
其中T为检测结果，D代表疾病状态，P(D+)代表患病率。

1.4 局限性
应该确定检测项目使用的局限性和禁忌，包括对结果准确性产生影响的因素（如这项检测不能检出的突变，性能不能满足最佳分析性能的项目）和检测的技术性局限（如干扰或抑制物）。

1.5 检测结果
正确解释准确结果需要对医学遗传学有广泛的了解，包括目标疾病相关的知识及其所涉及到的突变基因，同时也取决于患者填写的相关信息、检测项目的分析诊断特征。在某些情况下，检测结果的“确认”可能需要通过专家组的评审。对于特殊疾病的结果解释参考临床遗传实验室ACMG标准和指南。在三联体重复扩展疾病的检测时有可能会出现模棱两可的结果，如亨廷顿疾病。应该对数据进行分析和解释，并给出一个合适的处理（如重新取标本、重新检测或者报告结果）。

1.6 已建程序的验证
实验室所购买的商业化的仪器（已经过了确认）应该根据说明书进行验证。在报告结果之前实验室应该证明其性能能够满足厂家规定的准确度、精密度、可报告范围和参考区间。在美国，实验室如对所购买的仪器进行修改或引入新的检测系统（如自己开展的方法），应该根据目前的医疗保险服务中心（CMS）和美国临床实验室改进修正法案（CLIA）相关规定进行全面的确认。实验室还应该在报告患者结果之前为每个检测系统建立性能规范，包括适用性、准确度、精密度和分析特异性（包括干扰物质）、可报告范围和其他重要特性。实验室必须根据性能规范确定系统的校准和质控程序。应该记录性能特征建立、校准和质控程序的相关活动。若另外一家实验室已经完成了全面的确认试验，实验室可通过验证这家实验室的性能建立性能参数。这种方法可通过回顾性研究（盲样检测）或者前瞻性分割样品的研究来实现。

2. 检测试剂/试剂质量控制程序
所有使用的试剂都应该通过高质量的化学物和试剂级水配制。只有分析级纯试剂才适合于分子生物学检测，没有DNA和DNA酶。试剂和溶液都应该在合适的条件下保存。PCR试剂应该分成小包装保存以减少污染的风险。重要的新试剂应该在使用前进行确认，如果检测有限量的不可替代的标本或者需要快速检测以便临床诊治时，试剂的确认尤其重要。应该使用标准的方法进行DNA的提取和纯化，所得的DNA保存时应该防止其降解。应该有DNA提取回收率的文件记录程序，还应该有处理不足或量少标本及不满足要求标本的书面指南。

与其他实验室一样，试剂需要有标签、有效期和保存说明。PCR技术还需要特别的注意防止来自人体DNA和PCR产物污染标本和试剂。因此应该有分隔开的独立工作区域和设备用于试剂准备、标本制备和PCR产物分析。若有合适的空间将试剂准备、样品处理、扩增和检测人员分开，可以更容易控制交叉污染。为了避免污染，实验室应该使用无菌塑料制品（不含DNA酶和RNA酶）、热压处理过的试剂、一次性玻璃器皿、防气溶胶吸头、工作服保管、头巾、严格的标本流程。材料、容器和所有含有试剂的一次性用品都应该避免受到污染，并按照厂家推荐的试剂使用方法。可使用适当的质控物评估试剂的完整性和是否含DNA酶。

3. 设备校准和维护
实验室应该备有所有开展项目需要的仪器，并根据厂家的说明进行适当的维护。对于大型的仪器如自动测序仪，建议实验室与厂家签订服务合同包括每年公司提供一次预防性的保养。校准可能会影响检验结果，仪器应该有校准系统并进行常规的校准。实验室的校准和测量应该溯源到国际单位SI。仪器性能检查都应该有记录。计算机软件包括自带的软件都应该有记录并经过了适当的确认。热循环仪器、孵育箱、烤箱和水浴箱都有必要进行温度测试以保障扩增的有效性和杂交的严格性。孵育箱、烤箱和水浴箱应该使用校准后的温度计进行温度检测。热循环仪器用内置部件或外部热电偶进行温度监测。还应该检测单个孔和整个阵列孔的温度准确性和一致性。加样器在使用前进行校准准确度和重现性检查，之后要进行定期核查。

4. 内部质量控制和室间质量评价
内部质量控制和室间质量评价是保证检测结果高度标准化和结果报告有效可靠的一个关键环节，一般有三类质量控制。第一类质控：对技术人员的操作结果进行经常性的核查，主要是检查检测结果的重复性。如用空白样本（不含模板）进行PCR检查污染，用标定大小的标志物来检查PCR产物或DNA消化产物，正常控制物（检测基因上没有突变的DNA样品）的正确长度。第二类质控：核查检测结果的分散程度，即重现性。例如对同一份血液样品进行2次DNA提取，然后进行双份测定分析。也可检测阳性质控物。第三类质控：检查来自不同实验室的检测结果的分散程度（如参加有组织的室间质量评价或能力验证）。对于罕见疾病，可能没有相应的能力验证，实验室可与其他实验室交换样品并比较结果。如果没有其他的实验室交换样品，可以采用其他替代方法，如样本的盲法重检、与其他方法比较或者临床相关性的分析。

5. 阳性质控物
实验室应该使用阳性质控物来保证检测的有效性，这类质控物应该含有检测声明的突变范围。当检测脆性X染色体综合征和亨廷顿舞蹈病等三核苷酸扩展突变疾病的标本时，应该有包含正常大小和突变基因的质控DNA。质控物的检测可以监测PCR或者Southern印迹杂交过程，也可以为患者结果解释提供帮助。由于这些检测既是定性的又是定量的，所以应该包括截断值范围的上限质控物质，包括正常值、灰区、突变前期和完全突变。可制定等位基因梯度表与患者样品比较。多等位基因系统如微卫星位点，需要已知大小的等位基因监测PCR和电泳过程，同时辅助对样品等位基因大小进行解释。还有需要其他合适大小的标志物和测序梯度为等位基因大小的确定提供充足的信息。

当进行特殊突变分析时，有必要证明扩增和检测系统能够鉴别正常和突变的序列。序列特异性杂交和扩展系统应该有突变和正常的质控检测。对于平行检测多个突变的阵列系统（如囊肿性纤维化筛查），应旋转阳性质控物使得在n次检测过程中所有的n个突变质控物质都有检测（CAP分子病理学核查表）。此外，单个突变质控物可通过重组DNA和位点导向的突变发生技术进行合成，进而合成包含一系列克隆DNA片段的突变超级质控物。美国CDC通过Coriell Cell Repositories公司合成了很多验证过的质控DNA和无限增殖细胞株，包括含有相关疾病的靶突变，及这些突变表现出阴性的细胞株。很多厂家生产了其他的阳性质控物，实验室可自行选择。对于综合的测序检测，需要知道基因的每一个核苷酸组成来检测未知突变，如引入含有所有可能突变的质控物显然是不可行的。此时，测序本身及内源性的正常等位基因被认为是适当的质控物。

用到突变特异性消化PCR扩增物或限制性内切酶消化基因组DNA的检测必须进行质控检测确保限制性内切酶的活性和靶DNA在所用反应条件下可被消化。可在靶DNA或者在加入了标准的DNA靶位点附近引入一个酶切位点进行质控检测。同样的，用依赖于PCR扩增产物的存在情况来确定是否存在突变的检测可监测靶DNA的扩增和反应物中可能存在的抑制物。这可以通过加入无关基因（例如加入β球蛋白作为凝血因子V Leiden突变的质控物）或者加标靶DNA的特异性引物来实现。

三、分析后质量控制

1. 结果报告
报告是实验室根据遗传分子检测结果发给临床医生的一种特殊形式的文件，因此结果报告应该简洁、明了、准确、解释清楚、可靠和通过了授权。报告单应该用适当的形式、使用文字处理系统或计算机来创建。越来越多的实验室使用一体化计算机系统，带有结果报告模板，使用编码或自动加入文字的方式简化了报告书写。应该对报告系统进行适当的设置，从而是编码的文字具有意义、准确、适当并可用于大量结果的报告。

2. 保密和隐私
由于遗传信息很敏感且有可能被保险公司或雇主误用，所以检测和报告的所有环节都应该高度保密并且注意保护患者隐私。在美国，根据健康保险流通与责任法案（HIPAA）规定，美国公民有权利控制他们的医疗信息如何使用和公开。HIPAA的规定十分复杂，一般指患者有权利在任何时候查看自己的结果，并决定谁可以看或使用这个结果。这一点强调了检测前的咨询服务和遗传检测的知情同意。但是HIPAA的规定目的不在妨碍患者诊治。

3. 结果记录
记录保持应按照下述说明：记录应该注意保密性和完整性；只有授权才能发放记录；所有患者检测记录都应该可存取并易于恢复；文件应该可通过患者姓名或其它独特标识（如实验室接收编号或病例号）来查找恢复。与个人或家庭研究相关的文件应该注明相互参考。记录应该按照管理要求保存一段时间，重要遗传检测重要记录通常保存20年。国家级别的保密管理也适用于医学记录，尤其是敏感信息，包括纸质和电子记录（计算机、电子邮件和传真等），但是这样做的目的不是为了妨碍患者的诊治。

4. 报告
由于遗传检测结果可能直接或间接含有患者和患者家庭成员的信息，建议要保护所有涉及到的人员的隐私。遗传实验室在报告结果时应该考虑保密和隐私的原则。报告应该包括以下内容：

（1）患者标本的基本信息，通常包括患者的全名、出生日期、标本采集日期、标本属性、标本接受号和病例号。若同一个家庭成员有数个报告单，推荐还包括家谱或家庭编号。

（2）检测指征：重申需要解决的临床问题，通常包括三个部分：待检疾病/标记（如脆性X染色体综合征，囊性纤维化（CF）；申请（如诊断确认、携带状态）；指征，为什么申请检测（如发育迟缓、已知的家族史）。

（3）申请人员姓名。

（4）所用检测方法，包括待检突变，简单描述方法学和检测局限性。当实验室有多种可选方法时（如有反向斑点印记、荧光OLA或者检测CF突变的限制性分析）有必要说明使用的是哪一种方法。给出检测内容的详细信息（例如DMD缺失具体筛查的是哪一个外显子，CF查找的哪一个突变基因）。在报告阴性结果时，这一点尤其重要。提供检测的敏感度估计（受到影响的个体被检出的概率）。敏感性估计通常受所提供信息的影响（如CF或其他退行性疾病的种族/地理信息）。简单说明分析中用到检测技术对其他实验室分析患者结果是十分重要的。

（5）检测结果及描述。结果解释应该对于非遗传专家也能够读懂。若进行分析评估，应给出检测结果的定量预测值。如合适，报告中可包括家谱和家庭编号。在适当考虑提供的其他信息后针对临床提问，给出基因分析结果解释的最终说明。所给说明应该准确，不会产生误解。

（6）报告多个患者应该用分开的文件报告，这个报告最终会放入每个患者的或家庭的档案中。如数个家庭成员同时进行分析，对于是将他们的结果放在同一报告单上还是使用不同的报告单的问题，不同地方的管理政策不同，取决于疾病和分析特性，举例说明如下：两兄妹的亨廷顿预测结果应该分开报告；连锁标记研究只有在等位基因在数个家庭成员间遗传才有意义，因此报告单应该包括家庭成员的结果（通常使用遗传家谱）；如果是准备怀孕的夫妻筛查CF携带情况，他们需要的胎儿的患病风险，因此可以一起报告，也可以给出不同的报告单，注明参考配偶的结果；实验室发出的报告单应该清晰可鉴别，并有全部的细节内容。报告单有日期、页码和总的页数。

（7）实验室主任或授权个人的签名。

（8）不受实验室控制的其它因素可能造成的错误的免责申明。如提到实验室可能发生的差错或每一个报告单标本标签错误是不合适的。

（9）应该提供在风险计算或解释过程中引用的参考文献。一般只有在数据不被广泛接受的情况下提供参考文献。当不同文献有相矛盾的数据，应该仔细说明此报告中用到的数据。

 

参考文献
Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases;Approved Guideline—Second Edition. CLSI document MM1-A2 [ISBN 1-56238-615-8]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2006.