二、血凝仪的基本原理
不同类型的血凝仪采用的原理也不同,目前主要采用的检测方法有:凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集法等。由于在血栓/止血检验中最常用的参数,均可用凝固法测量,故目前半自动血凝仪基本上以凝固法测量为主,在全自动血凝仪中,也一定包括凝固法测量方式。
1. 凝固法(生物物理法)
凝固法是通过检测血浆在凝血激活剂作用下的一系列物理量(光、电、机械运动等)的变化,再由计算机分析所得数据并将之换算成最终结果,所以也可将其称作生物物理法。
a.电流法
电流法利用纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性的特点,将待测样品作为电路的一部分,根据凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。但由于电流法的不可靠性及单一性,所以很快被更灵敏、更易扩展的光学法所淘汰。
b.光学法(比浊法)
光学法血凝仪是根据凝固过程中浊度的变化来测定凝血功能。
根据待验样品在凝固过程中光的变化来确定检测终点的。当向样品中加入凝血激维蛋白凝块的形成过程,样品的光强度逐步增加,仪器据此检测出凝固终点,这类仪器也可称为平面磁珠法。早期平面磁珠法能有效克服光学法中样品本底干扰问题,但存在灵敏度低等缺点。
现代磁珠法出现在20世纪80年代末,90年代初进入商品化。现代磁珠法被称为双磁路磁珠法。双磁路磁珠法的测试原理如下:测试杯的两侧有一组驱动线圈,它们产生恒定的交变电磁场,使测试杯内特制的去磁小钢珠保持等幅振荡运动。凝血激活剂加入后,随着纤维蛋白的产生增多,血浆的粘稠度增加,小钢珠的运动振幅逐渐减弱,仪器根据另一组测量线圈感应到小钢珠运动的变化,当运动幅度衰减到50%时确定凝固终点。
2.底物显色法(生物化学法)
底物显色法是通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的,该方法又可称为生物化学法。检测通道由一个卤素灯为检测光源,波长一般为405nm。探测器与光源呈直线,与比色计相仿。
血凝仪使用产色底物检测血栓与止血指标的原理是:通过人工合成与天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序、并还有特定作用位点的小肽,并将可水解产色的化学基因与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性,它不仅能作用于天然蛋白质肽链,也能作用于人工合成的肽链底物,从而释放出产色基因,使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系,故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种,而最常用的是对硝基苯胺(PNA),呈黄色,可用405mm波长进行测定。
3.免疫学方法
在免疫学方法中以纯化的被检物质为抗原,制备相应的抗体,然后用抗原抗体反应对被检物进行定性和定量测定。常用方法有:
a.免疫扩散法。将被检物与相应抗体在一定介质中结合,测定其沉淀环大小,与标准进行比较,计算待测物浓度。此法操作简单,不需特殊设备,但耗时过长,灵敏度不高,仅适于含量较高凝血因子检测。
b.箭电泳。在一定电场中,凝胶支持物内的被检物与其相应抗体结合形成的一个个“火箭峰”,火箭峰的高度与其含量成正比,通过测定峰高并与标准比较进行定量测定。此法操作复杂,临床应用较少。
c.双向免疫电泳。通过水平与垂直两个方向进行电泳可将某些分子结构异常的凝血因子进行分离。
d. 酶联免疫吸附试验(ELISA法)。用酶标抗原或抗体和被检物进行抗原结合反应,经过洗涤除去未结合的抗原或抗体及标本中的干扰物质,留下固定在管壁的抗原抗体复合物,然后加入酶的底物和色原性物质,反应产生有色物质,用酶标仪进行测定,颜色深浅与被检物浓度呈比例关系。该法灵敏度高,特异强,目前已用于许多止血、血栓成分检测。
e.免疫比浊法。 将被检物与其相应抗体混合形成复合物,从而产生足够大的沉淀颗粒,通过透射比浊或散射比浊进行测定。此法操作简便,准确.
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