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‘医学检验’测试范畴 —自动分析仪性能验证 —— 读书笔记
杨振华
“HOKLAS补充标准 38 (HOKLAS Supplementary Criteria No. 38)”名称为“‘医学检验’测试范畴—自动分析仪性能验证(“Medical Testing”Test
Category – Performance Verification of Automated Analysers) ”*
*正体为中文翻译；斜体为我的评论
此文件为香港认可委员会在2010年发布[2] 。共分4章。
1 引言
1.1 ISO 15189要求所有器具在安装和临床应用时，要显示有能力达到所需的性能，并符合与检测相关的规格，所有方法必须尽可能地广泛地进行确认，以证明它们适合预期用途。自动分析仪在医学试验室工作中起重要作用，特別在临床化学和血液学部门；在微生物和传染部门则差一些。期望实验室在进入使用前，作为方法确认的一部分，对它们的自动分析仪进行全面的验证。评论：此文件突出了自动分析仪验证对医学实验室的重要性。但没有对医学实验室和自动分析仪生产厂家分別在验证、确认中的责任说清楚。读书笔记1的文件明确了厂家负责确认，医学实验室主要责任在验证，更明确地说是检查厂家已确认的主要性能，是否符合厂家声称的性能规格。此性能必须符合临床的要求，并常以招标要求来表达。
本节最后一句话“期望实验室在进入使用前，作为方法确认的一部分，对它们的自动分析仪进行全面的验证。” 很易给出错觉，似乎医学实验室不仅要做验证，还需进行确认。
1.2 验证的目的是决定：
(i) 评定的总分析误差是否在总允许误差之内；
评论：应改为“评定的测量不确定度与符合目标不确定度的要求。”
(ii) 实验室不同测量仪器所得的结果是否可比；
评论：这是很重要的一点，现代医学实验室往往有多台功能相似的自动分析仪。如何保证“实验室不同测量仪器所得的结果是否可比” 成为实验室常规工作的一项重要目标。
(iii) 新装置测量仪器是否适合应用需要。总允许误差包含3个主要贡献者：不精密度、方法特异的偏移和样本特异偏移，也就是干扰〔8〕。性能验证一定要包括精密度和正确度(方法特异偏移)的试验，以及其它对分析误差有贡献，并与临床相关的因素。
评论：大多数有关医学实验室的验证标准都强调，必须验证正确度和精密度。
1.3 CLSI颁布了一些评估自动生化仪不同试验所需的文件。建议实验室仔细研究这些文章，如何进行这试验，以及如何分析结果。此补充标准提供了总的确认(validating)自动分析仪试验的大纲。
期望实验室用于针对厂家声称的规格来验证(verify) 其性能并确认(validate)自动分析仪对其预期用途是否合适。本文件并不涉及厂家对自动分析仪的评估(evaluation) ，这是一个更为广泛的过程。此附加标准只适用于报告定量结果的自动分析仪，不适用于半定量和定性分析仪。
评论：此处使用了validate,verify,evaluate等动词，易使人混淆不清。但有一点是明确的，同是对自动分析仪进行评估，厂家必须详细全面的评估，证实其性能确实符合临床和患者的要求(validation)；而临床实验室主要对厂家声称的精密度和正确度规格进行评估，在临床实验室条件下，能否达到厂家声称的性能，也就是要达到临床实验室采购时设定的性能目标。
1.4 实验室应注意在使用前，必须确认(validate)用于解释自动分析仪结果的参考范围。请参考HOKLAS的附加标准32号“从其它来源确认生物参考区间”。
1.5 自动分析性能的验证是一个复杂过程，推荐在进行前要详细计划所做的工作，考虑之处可包括：使用什么类型样本，样本基体的影响，检测批次时间的选定，分析结果的方法和接受结果的标准等。在仔细的安排下，可以同时进行不同的实验，并可对同一组数据进行不同的研究和分析。
评论：在前一文件中，对此点进行详细叙述。总之，实验室主任必须负起责任，亲自领导，制定执行计划，提供充分的资源，指定有能力和资质的人员进行试验，最后审核验证报告并签字认可。
2 验证自动分析仪性能的情况
在如下情况下，应对自动分析仪进行验证：
a. 只要是新安装的自动分析仪都需验证，不论是否安装过类似型号的自动分析仪。
b. 置换旧仪器的新的同型号的自动分析仪。
c. 将一项测试从一个分析仪转到另一分析仪，就是同一型号也要验证。
评论：在上述3种情况，不少人都认为勿需再验证。实际工作已证实，同一型号不同分析仪的工作性能很难完全一致，存在差异。只是随厂家、型号不同，差异大小各异。
3 总的办法
3.1 当实验室使用自动分析仪，要制定自动分析仪的总的验证方案的标准操作程序〔SOP〕。SOP应包括：总的试验方案、样本类型、预期样本量、数据分析的统计方法、选定的可接受标准、以及每一种试验结果的解释。试验随分析物〔analyte〕和其应用而异，SOP应确定每一分析物〔analyte〕和其应用需验证的种类，并提供理由。当使用新的自动分析仪时，验证应涵盖所有分析物和应用。
评论：要做好验证，实验室主任要制定好验证方案。在此处将验证方案与SOP联系在一起。提出了SOP的主要內容，可供参考。
注意CLSI早就提出应用VIM术语“measurand” 取代CLSI以前用的术语“analyte” 。此文件仍使用旧术语。
3.2 3.3到3.10列举了验证自动分析仪所需的基本试验。此表并不完全，实验室还可考虑包括其它所需的相关试验。如果认为表中试验不适合某些分析物或某些应用，实验室要提供理由。当使用软件进行统计学分析时，要确定用此软件所得到的参数。
评论：此文件主要缺陷之一，就是没有像EP 15-A2那样，清楚将“verification” 和“validation” 区分开。本节中提出对已经厂家确认的自动分析仪，还要进行多达8个项目的验证。如减少还要说明理由。再加上一句“此表并不完全，实验室还可考虑包括其它所需的相关试验。”对临床实验室增加不必要负担。而在ISO15189中只提到正确度验证计划，甚至未提精密度验证。
3.3 精密度
3.3.1 不精密度定义为在特定条件下所得测量结果的分散度。常以术语标准偏差〔SD〕或变异系数〔CV%〕表示。分析已知浓度的患者样本、质控品、标准〔校准品〕、和其它适当的物质可用于决定精密度。所用样本最好有与患者样本相同或相似的基体。在连续5日内，每日对一个分析物，至少进行3次双份测量〔1〕。所有批次的重复测量次数都应相同。在某些情况，可能需要进行深入的研究，如在20日，每日运行一个批次对每一分析物测量以评估日间精密度。此时20日不需连续。期望在20个日的试验可提供更真实患者样本长期的变异情况。
评论：此文件将验证〔EP 15〕和确认〔EP 5〕具体测定精密度办法混同在一起。要了解患者样本长期真实的精密度，最好的办法是利用实验室IQC数据。按EP 5办法测定的不精密度一般都小于常规实验室IQC的实际不精密度。
3.3.2 实验中应包括2个浓度分析物。所选浓度应包括医学决定水平或者参考区间的上限或下限。
3.3.3 因为在不同日多次重复测量测定样本，样本必须稳定并且足量。
3.3.4 应以每一测定浓度的最大允许SD和/或CV%作为精密度目标。
实验室应在考虑新自动分析仪的偏移基础上，决定接受精密度的标准，这样总允许误差能在实验室特定的性能标准限内。总允许误差是每个样本结果与此样本真值之间最大允许差异。
评论：这是本文件又一重大缺陷。在此类配合ISO 15189的标准中，似不应该使用“总误差”，应改为“测量不确定度”。在3.3.4中精密度目标似应最后与“目标不确定度”，而不是与“最大允许误差”相关联。但另一方面，实验室还似乎应设置“最大允许SD和/或CV%”。目前此问题似无定论。可能是今后待解决问题之一。
如何理解文件中“实验室应在考虑新自动分析仪的偏移基础上，决定接受精密度的标准，” 这一句话?
3.4 正确度
3.4.1 测量正确度定义为多批次检测结果的均值与接受参考值之间的一致性〔1〕。一般以偏移估量正确度，偏移定义为上述2个值之差。如果比较方法不是参考方法，则无法判定新方法的偏移。在此情况，2法之差只能考虑为差异，而不是偏移〔2〕。
评论：这段话对中国ISO 15189实验室认可似乎有一定意义。过去有些同志认为只要按EP 9进行2方法比较，而且比对的是国际品牌自动分析仪，就能求得偏倚〔正确度〕，显然不是正确的做法。
CNAS有责任将适当的评定正确度办法用于实验室认可实际。
3.4.2 可以通过分析PT物质和其它参考物质来评估正确度，并将新的自动分析仪结果与期望参考值比较〔1〕。
评论：此处将与溯源到参考物质和根据PT结果2类评估正确度办法混在一起。此2类办法在今后评估正确度试验中可能起重要作用。但此文件只做一般叙述。CNAS是否可制定文件，详细介绍和推广此2类办法。
3.4.3 应至少使用2个浓度, 它们应在自动分析仪的分析测量区间，并在或近于推荐的医学决定水平。
3.4.4 也可通过将新的自动分析仪的性能与参考方法的比较来评估正确度，但对常规实验室，一般是不实际的也是不期望的。
评论：与3.4.1一致，强调了如要通过方法比较评定正确度，只有与参考方法比对。随着中国参考实验室网络的建立，与参考实验室比对有可能成为得到正确度数据的一个简单和实用的办法。
3.4.5 自动分析仪的每一分析物浓度的偏移不能大于最大允许偏移。正如在3.3.4叙述那样，实验室应在考虑新自动分析仪的精密度基础上，决定接受偏移的标准，这样总允许误差能在实验室特定的性能标准限内。可以绝对浓度或百比浓度来表达最大允许偏移。
评论：恐怕不是设定“最大允许偏移”。而是应按GUM原则修正偏移。但不等于偏移不影响测量结果。虽然修正了偏移，仍存在偏移的测量不确定度，此值有时甚至很大。
3.5 仪器间比对
3.5.1 新的自动分析仪的性能应与已有的自动分析仪进行比较。这样才可比较既往和现在的测量结果以监查患者的变化。
3.5.2 应使用涵盖整个分析测量区间以及与临床相关范围的患者样本。对比现有和新的自动分析仪的性能，可以在3—4日期间，每日在2个分析仪单次测量5-7个不同患者样本〔1〕。无须连续每日测量。不同日的测量可以均衡日间变异，这些变异可能在对比时存在于2个仪器。应绘制一个在x和y轴，有相同刻度和范围的2个仪器结果的散点图，并进行线性回归。使与所收集数据质量相称，恰当的线性回归模型〔最小2乘方法，Deming或Passing-Bablok〕。
3.5.3 当2组数据都有随机误差时，推荐使用Deming或Passing-Bablok回归方法，比较2个自动分析仪的结果。如果1个方法没有随机误差或者相关系数〔r〕足夠大，即r>0.975，自动分析仪结果则可使用简单的最小2乘方线性回归方法来评定它们的差异。
评论：此节对如何选择统计方法做了很好叙述。
3.5.4 应当制作Blatman--Altman〔差异〕图比较2个自动分析仪的结果。更多样本会增加统计评定差异的可信度。实验室必须确定2台自动分析仪结果间的可允许差异，并给出理由。
评论：未进一步说明如何制定“不同分析仪可允许差异” 。这可能也是待解决问题之一。
3.5.4 当同一实验室使用1台以上自动分析仪进行同一测试，它们的结果必须是可比的，这样在常规工作中可以交换使用自动分析仪。所以，应定期进行仪器间比较，以保证它们差异在长期基础上，都在允许的可接受限内。应按3.5.63和.5.7进行比较。
3.5.5 一般推荐用覆盖整个分析测量区间或与临床相关全部范围的40个患者样本，定期比较不同自动分析仪的性能。试验只要包括在线性报告范围內的浓度。
3.5.6 可以在〔日、周〕频次、或定期监测〔每季、半年〕基础上在不同自动分析上测定患者样本，测量频率与测量系统稳定性相关〔4〕。一段时间收集的数据可以进行回归处理以及对偏移进行统计学分析。当对比超过2个自动分析仪时，可用ANOVA分析结果。应每季度或半年统计分析短期监测频率〔1日或1周测几个样本〕所收集的数据。当实行频繁监测时，实验室还应确定每对结果间允许差异的可接受标准。
评论：“3 . 5仪器间比对”似不应为验证内容。更像是为达到ISO15189中“5.6.6 当同样的检验应用不同程序或设备，或在不同地点进行，或以上各项均不同时，应有确切机制以验证在整个临床适用区间内检验结果的可比性。应按适合于程序和设备特性的规定周期验证。”所需采取的措施。CLSI为此制定了C 54“在同一保健系统內验证患者结果的可比性” 。
3.6 线性
3.6.1 线性是自动分析仪提供分析物结果在一定范围与该分析物在样本中浓度直接成正比。报告范围內的线性误差应在医学允许容差内。用于验证线性的样本应与患者样本的基体密切比配。用于试验分析物的浓度应涵盖临床相关范围，包括所有医学决定水平。至少使用5个不同浓度，建议每一浓度验证时测量3次。可使用商品标准组和实验室自行制备的含一个高浓度不同稀释的样本组来验证线性。
3.6.2 线性是一个化学概念，涉及到反应信号强度与分析物浓度之间的关系。血液学自动分析仪的功能基本上是颗粒计数器，可将血液稀释来研究线性，自动分析仪报告预期的浓度。虽有商业化的“线性试剂盒” ，但此物质〔颗粒、基体〕常显著不同于新鲜全血，不能准确地反应仪器分析新鲜血液的性能。用于线性研究的物质应有新鲜血液对分析仪的基体效应。最好使用浓缩或稀释的新鲜血球。
评论：线性检查是否为确认试验重要内容之一，CLSI专门为线性检查制定了EP 6“评估定量测量程序的线性”。虽然CLIA 88规定美国临床实验室应对正确度、精密度和线性进行验证。但多数标准只规定验证前2项〔EP15〕。CNAS是否要对验证内容做明确的规定？
3.7 检测限和定量限
3.7.1 检测限〔LoD〕定义为样本中按特定概率能检出分析物的最低量〔6〕。一般是基于对至少20个零校准品或空白样本的双份测量，以均值加2SD或3SD报告。验证厂家的自动分析仪声称LoD，至少要使用声称LoD的20个结果。
3.7.2 有时将定量限〔LoQ〕称为功能灵敏度，是样本在规定条件下，在伴随规定可接受精密度和偏移情况，能定量分析物的最低量〔6〕。要测定LoQ，必须研究若干个低浓度分析物的样本，来决定低浓度范围内精密度的分布情况。只要可能，所用的空白和低浓度样本必须与自然样本相似。能达到预先设定变异系数〔CV%〕的浓度可认为是LoQ。用于测定每1浓度CV%的最少双份测定次数为20。实验室所用的预先设定的变异系数〔CV%〕要得到引用文献的支持。
3.7.3 需要测LoQ的项目，一般为检出低浓度很重要的免疫分析〔如肌钙蛋白、前列腺抗原、促甲状腺激素〕。在血液学，因子分析〔7〕和在某些临床情况，准确定量低WBC和低血小板可能很重要时，要考虑LoQ。
3.7.4 为验证声称的LoQ，实验室可能要测定在预先设定CV%和低于LoQ的样本，预先设定的CV%对TSH是30%，对肌钙蛋白为10%，以验证声称的LoQ。
评论：LoD和LoQ都是确认项目，而非验证项目。这2参数主要对低浓度测量对临床有意义的测试，才显示其价值，特別是LoQ〔在临床上多称为功能灵敏度〕。至今似乎尚未制定判定功能灵敏度明确的办法。3.7.2将LoQ定义为“样本在规定条件下伴随规定可接受精密度和偏移能定量分析物的最低量”，LoQ不仅与精密度相关，还与偏移相关？在实际工作中精密度往往只进行重复性测量，是否恰当？
3.8 携带污染
3.8.1 携带污染是一个样本被前一个样本或使用的试剂所污染。最常见是由于样本针暴露在前一个样本或试剂的污染。
3.8.2 可以先测试一个高浓度样本3次，随后测试一个低浓度样本3次。测定血液分析仪的携带污染时，因为基体效应和细胞成分不同，不可用商业质控品取代人新鲜全血。
评论：此为某些分析仪特有的分析性能。不存在大多数测量程序中。此工作应由生产厂家负责，并将信息提供给使用者。
3.9 干扰
3.9.1 实验室应在厂家信息是否恰当以及测试预期用途的基础上，决定自动分析仪验证试验是否包括干扰试验。实验室应该采用厂家提供的干扰信息。将应用厂家标准和数据的原则制成文件。当干扰物质浓度看来会引起错误时，需要有适当的处置。应该在测试报告中提供对这样检测结果的评论。
3.9.2 临床样本最常见的3种类型干扰为脂血、溶血、或黄疸。当实验室进行干扰试验以证实能引起测试结果显著差异的干扰浓度，可以通过分离样本和添加干扰物质来进行。
3.9.3 将样本分为2份，试验时1份加入干扰物质，1份不加。加入样本中干扰物质不应超过样本体积的10%，以避免样本基体的任何明显变化。在不加干扰物质的样本中加入同等体积的稀释液以补偿稀释效应。添加样本中干扰物质浓度应为临床实际常见情况。对此成对样本应双份测量。
3.9.4 干扰物质引起的总误差不应引起医师对患者诊断、治疗、或管理决定的改变。当总误差小于总允许分析误差时，临床上可接受混有干扰物质患者的分析结果。
评论：与3.8相似，此工作应由生产厂家负责，并将信息提供给使用者。不应由实验室进行。实验室应制定程序，能恰当处理由于干扰引起结果差异，例如在结果报告中进行评论。
3.10 高剂量的钩状效应
3.10.1 应该研究使用夹心法的免疫分析方法的高剂量钩状效应。
当患者样本中分析物浓度超过捕获和信号抗体的结合能力时，抗体不能形成抗原—抗体复合物，结果严重低测了分析物浓度。
3.10.2 应该用高分析物浓度的患者样本来证明厂家摆脱高剂量钩状效应的声明。高浓度样本可以是实验室的贮存样本或来自其它实验室。当得不到高浓度样本肘，可以在自动分析仪用于常规服务后进行。
3.10.3 实验室在测试时，可将样本适合当稀释来检查自动分析仪的期望浓度。要将自动分析仪无钩状效应的最高浓度制成文件。当自动分析仪正确地报告更高浓度的样本时，应更新无钩状效应的分析物浓度。
评论：钩状效应主要见于夹心法的免疫分析方法，虽然项目不多，但其后果严重，临床往往因此做出不当诊断和治疗。临床实验证应给予高度关注。但这是试剂开发者确认的重要內容，而非临床实验室必要的验证项目。
4验证报告
应对测试的自动分析仪制定一个经过适当评审和签字的完整书面验证报告。验证报告应包括，但不限于如下内容：
a．进行验证人员的姓名。
b. 验证目的。
c. 验证时间和涵盖的分析物和应用。
d. 自动分析仪的名称和型号，以及仪器序号。
e. 对每一分析物和应用，详细记录所进行的每一试验, 包括所用样本的类型和数量，样本测量批次和次数，试剂批号和失效期等以及所得结果。
f. 用于每一试验数据分析的统计方法以及可接受标准〔应在试验前确定〕。
g. 以适合当的图表和分析总结数据。
h. 结果和结论。
i. 如有，局限和注意。
j. 参考文献
对此标准总的评论：
作为2010年颁布的地区标准，似乎比较陈旧和过时，表现在：·未将“verification” 和“validation” 分清。要求临床实验室验证过多项目；
· 几乎全部无批判地引用美国CLSI的标准，未参考其它特別是欧洲标准；
· 坚持使用“总误差”，不提“测量不确定度”。明显不符合ISO15189的要求；
· 对如何评定“正确度”缺乏实际可操作的说明，应用此导则者可能很难达到ISO 15189的要求；
· 甚至仍使用旧CLSI术语，如analyte，而不使VIM术语。但有一些优点，可供我们借鉴：
· 标题为“自动分析仪的性能验证” ，更符合常规实验室的实际；
· 在每一项试验中，用简练的字句，叙述了CLSI文件要点；
· 在“2验证自动分析仪性能情况” 提出了3种我们可能认为无需进行验证的情况；
· 3.1提出“要制定对自动分析仪的总的验证方案的标准操作程序〔SOP〕。”；在3.4.1提到 “如果比较方法不是参考方法，则无法判定新方法的偏移。在此情况，2法之差只能考虑为差异，而不是偏移〔2〕；
· 3.5.3提到“当2组数据都有随机误差时，推荐使用Deming或Passing-Bablok回归方法比较2个自动分析仪的结果。如果1个方法没有随机误差或者相关系数〔r〕足夠大，即r>0.975，自动分析仪结果则可接受用简单的最小2乘方线性回归来评定它们的差异。”
总之，现在应该在ISO 15189认可中，在吸收国外标准的优缺点的基础上，制定出我国的标准。首先可能是有关“正确度验证计划”的标准，其次是“校准计划”的标准。
参考文献
1. User Verification of Performance for Precision and Trueness;Approved Guidelines -Second Edition. CLSI document EP15-A2 (2005).
2. Patricia L. Barry BS, James O. Westgard. Method validation –The replication experiment. 1999 https://www.westgard.com/lesson22.htm (accessed
10 December 2009).
3. Method Comparison and Bias Estimation using Patient Samples; Approved Guidelines – Second Edition. NCCLS (now CLSI) document EP9-A2 2002).
4. Verification of Comparability of Patient Results Within One Health Care System;Approved Guideline, CLSI document C54-A (2008).
5. Validation, Verification, and Quality Assurance of Automated Hematology Analyzers; Proposed Standard – Second Edition. CLSI document H26-P2 (2009).
6. Protocols for Determining Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. NCCLS (now CLSI) document EP17-A (2004).
7. Protocol for the Evaluation, Validation and Implementation of Coagulometers;Proposed Guideline, CLSI document H57-A (2008).
8. Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline – Second Edition,CLSI document EP07-A2 (2005).
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