一种新的测量HbA1c的方法

最近有一种新研发的技术，能直接测量总血红蛋白，随后测量糖化血红蛋白，五分钟内得出结果。

血红蛋白 A1c (HbA1c) 是唯一一个适于诊断糖尿病和监测糖尿病治疗的分析物，每年执行的检测都有一个明确的数量（通常是以季度计算的）。联合国，世界卫生组织（WHO），和国际糖尿病联盟 (IDF)共同起草的行动方案满足了全世界糖尿病盛行问题和对更好的诊断和治疗的需求。在 2010 国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP) 厂商论坛上，IDF总裁请求商用HbA1c检测系统的厂商去考虑如何向不发达国家提供准确、可靠的HbA1c检测，因为不发达国家无力购买当前在市场上销售的检测。一些目前的百分比血红蛋白A1c (%HbA1c) 检测方法包括离子交换或亲和柱色谱分析法-为基础的检测，都很贵并且不可移动。其他方法结合了免疫分析法(需要冷藏储存)和/或相对昂贵的试剂和测量仪。

现在已经开发了一种技术，考虑到设计低成本系统，能满足发展中国家的糖尿病检测需求。技术核心是 (在美国专利7195923 和7695973中有所描述) 是一种分离基体，经过化学修饰，包含了带阴电荷基团和硼酸盐基团。当流过基体的缓冲液的pH是酸性的，带阳性电荷的糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白与带阴电荷基团结合。当pH为碱性时，血红蛋白失去电荷，从离子结合体中释放出来。pH为碱性时，硼酸盐不仅结合顺式-二醇，还结合了糖化血红蛋白的葡萄糖，该糖化血红蛋白是抓住基体中的糖化血红蛋白的。每个条件下的基体中结合的血红蛋白通过使用血糖仪类型的测量仪读取膜的反射率测量值来进行量化。膜可以与单一试纸条合成一体，无需冷藏保存。使用这个技术的系统，就能支持在发展中国家和发达国家广泛用于糖尿病的诊断和监测。

分离基体制备

用于分离基体的基础膜是一种亲水性的、有渗透性的膜，其孔径大小足以通过红细胞。Sartorious 生产的Sartobind A 膜和Porex Corp. (Fairburn， GA)生产的Lateral-Flo膜均可用作基础膜。通过膜的样本和缓冲液的运动可以是横向的，也可以是垂直的。

下面描述的产品是使用了横向流动结构的膜。膜的厚度会影响测量灵敏性，较厚的膜能结合更多的血红蛋白。一个10密耳厚的膜不能结合足够的血红蛋白，以在原型体检测系统中提供恰当的信号。厚度至少要有15密耳，才能提供足够的结合力和信号。因为反射率是在膜上进行测量得到的，膜表面应相对均匀以最小化结果在试纸条之间的差异。检测的两种膜都含有共价连接的羧酸基团，其功能是作为该技术中的带阴电荷基团。

然后将硼酸盐基团加入到膜中，使用碳化二亚胺 1- 乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）将m氨基苯硼酸盐(APB) 共价连接到膜中已有的羧酸基团。随着反应时间过去，越来越多的硼酸盐基团被加入到膜的羧基基团中。羧酸基团数量减少，结合的总血红蛋白就减少。随着硼酸盐的数量增加，糖化血红蛋白结合达到稳定水平。控制反应时间，以达到最佳糖化结合，而不会出现显著的总结合减少。

检测细节

检测开始是添加第一个缓冲液(pH 6.5)，取一个参考反射率测量值。每个试纸条的100%反射率设置为一个参考物质测量到的反射率。试纸条插入仪表后立即出现的膜反射率就是可使用的逻辑参考值。但是，使用缓冲液流过时膜的反射率可改善检测精密度。在一个实验中，如果仅使用膜作为参考，一个正常样本的检测精密度为5.5%。如果使用有缓冲液流过的膜作为参考，精密度为2.9%。

随着缓冲液继续流动，添加血样并使其冲洗通过膜。缓冲液也包含了一种清洁剂，能溶解血红细胞以释放血红蛋白。pH 为6.5时，非糖化血红蛋白和糖化血红蛋白是带阳性电荷的，通过离子作用结合到基体上的带阴性电荷基团。随着血红蛋白移动穿过基体时迅速结合。pH 为6.5时，硼酸盐基团的结构形式是不利于结合糖化血红蛋白，因此其绑定的血红蛋白比例应与样本中的糖化血红蛋白比例相同。添加足够的缓冲液，以从基体中去除非结合（多余）的血红蛋白。基体中结合的血红蛋白的量使用反射率测量值表达为总蛋白。光源是一个LED灯，标称波长为430nm，使用血红蛋白的415-nm吸光度峰值用于定量检测。

第一次测量后，添加pH为9.5的缓冲液，使其冲洗通过膜。血红蛋白的电荷改变，离子结合反向。硼酸盐基团变为利于结合糖化血红蛋白的结构，因为糖化血红蛋白从带阴性电荷的基团中释放出来。随着血红蛋白通过基体，迅速与硼酸盐基团结合。结合到基体的血红蛋白的量使用反射率测量值表达为糖化血红蛋白。两个结合步骤都很迅速，使基体能适应穿流方法或者横向流动方法。

图 1.横向流动检测期间的反射率变化

图 1显示了随着检测进行，反射率的变化（与干试纸条反射率相对的%R）。添加第一个缓冲液时（1），因为基体变得更透明，反射率下降。加入血液后（2），因为高浓度的血红蛋白的正面通过基体，吸收了光，反射率下降。随着未结合的血红蛋白冲洗通过基体（3）反射率增加到稳定水平，由于离子作用结合的血红蛋白仍在基体中进行反射率测量。当添加第二种缓冲液时(4)，反射率最初下降，然后随着非糖化血红蛋白正面流动通过基体，反射率增加(5)。由于糖化血红蛋白留在基体中，反射率增加到一个稳定水平，进行第二次反射率测量(B)。使用两次反射率测量值 (A 和 B) 计算总血红蛋白浓度和糖化血红蛋白浓度。使用糖化血红蛋白相对于总血红蛋白的比例计算样本中的 %HbA1c ，描述如下。

下面描述的检测使用2-5 μL样本就可进行检测。膜的厚度和血红蛋白结合位点影响最小样本体积。检测的样本可以是毛细血管血，用含有抗凝剂（通常是EDTA）的试管采集的静脉血，用含有抗凝剂的试管采集的冷冻静脉血，和质控品。使用原型系统，85 μL的第一种缓冲液和55 μL的第二种缓冲液足以执行冲洗。检测时间约为5分钟。添加第一种缓冲液后，读取湿的试纸条空白，如果推迟太长时间添加血液，会使缓冲液流失过多，不能完成冲洗。因此，血样应在读取湿试纸条反射率后15秒内添加。添加第二种缓冲液的时间不是关键的。

该检测方法学有几种优势，包括如下：
? 在检测的离子结合步骤，不仅血红蛋白被洗出试纸条，同时还有血样中的其他未结合成分。这个步骤可在进行反射率测量前从测量区去掉可能的干扰物质。

? 第一种缓冲液结合的血红蛋白中的非糖化血红蛋白和糖化血红蛋白量将会与样本中的非糖化血红蛋白和糖化血红蛋白浓度成正比。因此，与第一种缓冲液结合的血红蛋白的量的变化会导致与第二种缓冲液结合的糖化血红蛋白成比例的变化。因此，总血红蛋白测量值的变异与糖化血红蛋白测量值的变异相等。使用糖化血红蛋白/总血红蛋白比计算%HbA1c 消除了变异的影响。 因此最小化了由于成分造成的试纸条间变异和生产变异。这可见于图2，显示了来自相同样本的多种检测的结果。不同检测中结合的总血红蛋白的浓度的变异与糖化血红蛋白浓度的变异相等。图2中提供的精密度结果说明了比值比的不精密度远远小于从总血红蛋白和糖化血红蛋白不精密度预测得来的不精密度，如果这两个不精密度是完全独立的话。

图 2.两个测量值中的相同差异

· 总血红蛋白和糖化血红蛋白是使用相同光源和检测器在基体上相同位置测量的。最小化了两个测量值之间的变异，使检测精密度得以改善。

· 膜是仅由共价结合的，带阴性电荷的羧基基团和硼酸盐基团组成的，不含有任何不稳定蛋白质或标记化合物。膜固有稳定性，无需冷藏，使其用于发展中国家很理想。

· 膜是该检测的唯一活性成分，可被整合到许多设计中，这些设计可以是简单的、便宜的、或更复杂的。

原型系统

要证实该技术测量%HbA1c 的灵活性，可将其整合到一个简单的检测系统中。该检测系统的成分包括缓冲液 A (pH 6.5)，缓冲液 B (pH 9.5)，保存在一个干的(硅胶)小瓶中的试纸条，一个敷料器便于以横跨膜的线添加样本，以及一个手持血糖仪-类型反射率测量仪(标称430-nm LED；见图 3)。仪表上的试验试纸条支架包含一个孔，插入试纸条时该孔对准膜的末端。该孔为缓冲液添加处，缓冲液从此处流进膜。试验试纸条支架也设计有插槽，用以抓住敷料器的两条腿，将包含样本的线正确置于膜上。

图 3. 原型检测系统的成分
Porex Lateral-Flo膜含有硼酸盐基团，其制备如上所述，被用在试纸条设计中，是为了利用此膜的横向流动属性。 (见图 4)。膜位于塑料支撑上，反射层位于读数区上，吸收剂水槽收集缓冲液和洗涤了的血液。缓冲液通过测量仪上的孔添加到膜的一端，顺着缓冲液流下添加血样。缓冲液推动血样通过膜到另一端的水槽。在贯穿膜的过程发生结合，在敷上血液处和穿过塑料支持上的水槽之间测量反射率。

图 4. 原型检测系统中使用的试纸条的原理图。

试纸条使用手工叠片方法组装成卡片。不同成分的条板贴到塑料基板上，基板上事先涂有粘合剂并有穿孔。各成分使用多层双重粘合胶带粘在一起。每个卡产生50个试纸条，使用一个切纸机从卡上切下来。使用这个方法生产成批的试纸条，最多5000 个试纸条。

计算

在原型系统检测中，如上所述，仪表测量总血红蛋白和糖化血红蛋白的反射率。这些反射率测量值转换为血红蛋白浓度，计算糖化血红蛋白/总血红蛋白比值。通过标准化比值到参考方法的%HbA1c 结果，比值可转换成参考%HbA1c 值。下面描述的研究中使用的参考方法是一种硼酸盐亲和HPLC 法，其%HbA1c 试验结果标准化到糖尿病控制和并发症试验 (DCCT)值。

反射率和浓度之间的关系是非线性的，是为使用的膜的类型进行实验测定的。不同血红蛋白浓度的样本在没有血红蛋白结合的条件下穿过膜。随着样本流过测量区域，为每个浓度进行反射率测量。浓度vs反射率数据符合4参数逻辑方程。该方程将在检测期间得到的反射率测量值（例如图1中的点A和B）转为相应的血红蛋白值。

糖化血红蛋白浓度（B点测量值）除以总血红蛋白浓度（A点测量值）以得到糖化血红蛋白/总血红蛋白比。该比值与参考方法测量到的HbA1c 浓度呈线性相关 (见图5)。图5 显示了从5个病人的血样的多个检测得到的数据。线性相关性（斜率和截距）将比值转化为参考%HbA1c值。

图 5. 5个病人样本的比值图 vs. %HbA1c

技术性能

技术性能使用原型系统进行研究。研究包括对比检测结果与参考方法，测量检测精密度，测定检测线性，使用温度压力测定试纸条稳定性。

使用原型系统得到血样检测结果与使用NGSP二级参考方法在相同样本上得到的检测结果进行对比。NGSP 提供了一个方法以将HbA1c试验结果标准化到两个研究：DCCT和英国前瞻性糖尿病研究 (UKPDS)。这两个研究已经确定了糖尿病患者HbA1c浓度和长期问题之间的关系。NGSP 设置了对比来自新技术的试验结果和参考方法试验结果的标准，以两组结果的偏移为基础。当满足标准时，试验方法合格。

从密苏里州大学，NGSP的一个主要参考实验室，得到来自40位患者的冷冻全血样本。这些样本使用硼酸盐结合HPLC 方法进行检测，该方法被NGSP用作二级参考方法。这些样本使用原型系统重复两次测定。样本范围从 5% HbA1c - 11% HbA1c，其中9个在 5% - 6%，7个在6% - 7%，24 个在7% - 11%。

使用原型系统的检测结果vs参考方法的最小平方回归分析给出回归公式Y=1.21X –0.12，其中，Y是原型 A1c，X是参考A1c。统计分析显示斜率为 1 (P=0.394)，截距为0 (P=0.397)。相关系数 R2为 0.971，证明使用原型检测得到的%HbA1c结果与使用参考方法得到的结果有良好的相关性。图6 显示了原型检测结果和参考方法检测结果之间的偏移图。偏移结果的95% 可信区间范围落在2011 NGSP标准内，该标准用于认证到DCCT和 UKPDS研究结果的溯源性。

图6. 偏移图 (Scripps参考方法)。

原型系统的精密度测量使用来自静脉血样多个检测的结果(保存在 4℃)，由2个操作者使用两个批次的试纸条连续操作两天。每个操作者为每个批次每天运行8个检测（每个批次总共32个检测）。批次1的总结果是平均%HbA1c为5.2，其CV为3.1%。批次2的结果是平均%HbA1c 为5.4，其CV为2.8%。对数据的方差进行双向分析，显示无统计显著的日间方差 (P=0.238)或操作者间方差 (P=0.238)。

检测的线性使用正常质控和高值质控的混合物的检测的结果得到证实。结果表明检测对至少16%的HbA1c 有线性响应，并且精密度在线性范围内一致。(见表 I)

表 1. 线性和精密度

膜的稳定性测定方法是将试纸条置于加速老化的处理中，并将其保存在高于45°C的温度。（较早的研究显示，如果膜在75%相对湿度坏境的时间过长，血红蛋白与膜的离子性结合会受影响。因此试纸条密封保存在含有硅胶干燥剂的小瓶中。）一个静脉血样冷冻分装保存，检测以不同的保存时间间隔执行，每次使用一个新的小瓶。每个保存时间间隔也使用室温下保存的试纸条来检测血液作为质控，因为血样随着时间过去可能发生了变化。图7提供了两组试纸条不同保存时间间隔的%HbA1c检测结果。

图 7. %HbA1c 检测结果的稳定性。

与天-0结果对比，检测结果证明试纸条在45°C时测量%HbA1c 的性能不会衰减，至少能保持365天。在45°C保存的试纸条提供的检测结果与在每个保存时间间隔在室温保存的试纸条的检测结果相同。这些检测结果也表明了不管在二者之一的哪个温度，总血红蛋白结合或糖化血红蛋白结合不会衰减，至少能保持365天。这证明了带阴性电荷基团和硼酸盐基团在保存期间在两个温度都能保持其官能度。

可能干扰物检测初步结果表明，血红蛋白变体HbAE， AD， AC， AS，胆红素和脂血不会影响检测结果。血液成分几乎也不会产生干扰，因为在取测量值之前大多数会在读数区冲走。化合物要产生直接干扰，不仅应结合光还要吸收测量波长的光。此外，由于使用比值计算%HbA1c，相同的糖化血红蛋白减少就能对总血红蛋白结合减少进行补偿。

结论

使用描述的结合技术，可开发一种低成本的HbA1c 检测系统。系统可使用一种手持反射率测量仪用于测量。化学修饰的膜是稳定的，使系统有足够的稳定性，无需冷藏。因此，有可能开发一种相对低成本的系统，能够在发展中国家使用。该技术也可整合到更复杂的系统中用于床旁快速检测使用。

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