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凝血功能及血栓性疾病的实验室诊断进展
二十世纪四、五十年代凝血因子的新发现，推动了凝血机制认识的发展。1935年Quick首次描写了凝血酶原时间（Prothrombin time, PT）测定,时至今日PT以及此后发展的活化部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplatin time, APTT）、凝血酶时间（Thrombin time, TT）、纤维蛋白原(Fibrinogen, FIB)等测定已成为临床凝血功能检查的常规项目，为临床诊断和治疗提供了重要帮助。近二十年来随着科学对凝血机制认识的进一步深入以及检验仪器及技术的迅速发展，血凝及血栓性疾病的实验室诊断技术和方法又有了很大进步。一方面，常规的凝血检查向标准化、规范化和实验室间可比化发展，另一方面，对血小板、D-二聚体(D-dimer)和纤维蛋白（原）及其降解产物（Fibrin degradation product,FDP）在凝血功能中的重要性有了深入认识，同时还发现了一些新的促凝物质。功能各异的凝血功能自动化检测仪器，如全自动凝血
功能检测仪、全自动血流变检测仪、血小板聚集仪和血栓弹力图仪等不断推出。本文旨在总结凝血机制研究及检查的新进展、新发现，同时对凝血机制检查的全自动仪器作一介绍。
一、凝血功能检查的新进展
1．凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）测定的标准化
2000年卫生部颁布了412号文件，即《出血时间、凝血时间检测方法操作规程的通知》，淘汰了手工玻片法凝血时间和Duke法出血时间测定。规定用APTT或全血凝固时间（Clotting time, CT，试管法）测定取代凝血时间测定的玻片法和毛细管法；用ATPP、血浆PT和血小板(PLT)计数联合检测取代出血时间测定。PT和APTT分别是评价外
源性凝血途径功能和内源性凝血途径功能的指标，是目前临床最常用的筛选试验，是凝血因子功能检测和抗凝药物疗效监测的首选试验。但相当长一段时间，由于各实验室采用的方法、仪器、试剂、标准血浆不同，使各实验室间PT结果不具可比性，也难以进行质量控制，因此，WHO于1983年提出PT的标准化报告方式为国际标准化比值INR（International normalized ratio, INR）。1985年国际血液标准化委员会（International Committee for Standardization in Hematology，ICSH）和国际血栓与止血委员会（International Committee on Thrombosis and Hemostasis，ICTH）也均指出“今后医学科学论文如其PT值以‘s’、‘比值’和‘活度’等来报告而不提供其INR值，将不予接受”。INR比值是病人PT与正常对照PT之比的ISI次方，计算公式是：INR＝PTRISI，凝血酶原时间比值PTR＝患者PT(秒)/正常参比血浆PT（秒）。ISI为国际敏感度指数（International sensitivity index, ISI）反映试剂对Vitamin K依赖的凝血因子水平的敏感程度，通过国际参考品（International reference preparation，IRP）来溯源。它是WHO以人脑凝血活酶67/40批号作为标准品，以国际敏感度指数表示各类试剂与67/40之间的关系，用多份不同凝血因子水平的血浆与国际参考制品（IRP）进行严格校准，通过回归分析求得回归斜率而得到，代表凝血活酶试剂对凝血因子缺乏的敏感性。67/40为原始参考品，ISI为1.0。要求商品化的试剂每批产品必须确定ISI值，并尽可能与1.0接近。这样，同一份标本在不同的实验室，用不同的ISI实际检测，PT值结果差异可能很大；但INR值相同，从而使测得的结果具有可比性。
目前，常用的国际参考品有下列几种：
（1）单一组织凝血活酶参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂。WHO的原级凝血活酶参考品（Primary reference preparation）是以统一标准的“英国比较凝血活酶”（BCT）为基础，如人脑组织凝血活酶，编号67/40。此后，又以BCT/253(人脑)代替WHO早期的67/40，作为原级标准，并于1985年以ICSH/ICTH的名义公布。同时，又以BCT67/40为基础标化了次级参考品，如牛脑组织凝血活酶，编号68/434。
（2）复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量的纤维蛋白原、因子ⅴ和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等。世界各国都广泛应用WHO的这些参考品来校正本国或本地区制备或生产的组织凝血活酶参考品[1]。这一系列规定的重大贡献是使实验室间检测结果具有可比性，同时便于质量控制。但是，研究者逐渐发现，随着凝血分析仪在凝血功能检查中的广泛应用，自动化仪器测得的PT结果可因仪器的型号和检测原理的不同而有差异。不仅试剂影响INR，仪器也能影响INR，而且有时会产生较大误差。如在ACL、Cobas Fibro和CoagaPt 三台自动化凝血分析仪上使用同一种ISI为1.12的Thromborl S试剂，结果测定的PT均值分别为10.7秒、12.1秒和11.1秒。但若以同一ISI值计算INR，得出的数值也存在着不同程度的差异。为此，专家们建议，同一组织凝血活酶试剂应用于不同仪器时，可用所谓的“仪器特有的ISI”(Instrument specific ISIs )或称区域性ISI（Local ISI）来计算INR。这就要求每台仪器所使用的凝血活酶试剂都应该有特定的重新标定ISI值，重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆，然后在各自的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值，这样才可使病人的INR具有可比性。
虽然INR的应用提高了实验室间凝血检测结果的可比性，使结果更为准确、可靠，但由于PT和APTT检测受到检测前、中和后各种变异的影响，尤其是实验条件和环境、试剂与仪器、检测原理和方法等因素的影响，为实验室间检测结果的比较和质量控制带来了困难。
因此，统一凝血检测标准成为凝血检测发展的必然。2005年至2008年美国临床和实验室标准化委员会CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）先后颁布了：H47-A2 PT和APTT一步法实验-批准指南第二版[2]、H54-A INR确认过程和PT/INR系统的实验室校准-批准指南[3]、H58-A 聚集仪检测PLT功能实验-批准指南[4]。
H47-A2是一个由H28-T（推荐指南）和H29-T两个推荐指南合并后形成的批准指南，是一系列血液凝集方法学指南的一部分，建议与H54-A和H57-A共同使用。指南描述了采用柠檬酸盐血浆一步法PT和APTT常规检测技术操作的原理和必要规程。实际上，这两项实验都是测定的激活测试血浆后形成纤维蛋白凝块的时间。H54-A批准指南的目的是对负责报告病人INR结果的生产厂商和临床实验室的技术人员提供指导。该指南分为两部分，第一部分定义了校准曲线、定标血浆、通用国际敏感指数、国际标准化比率、国际参考品（International Reference Preparation，IRP）等的概念，并对校准过程、材料选择、精密度、不准确度等作了详细、全面的描述。第二部分是应用于临床实验室的缩写版本，适用于负责PT分析工作的专业实验室。指南提供了计算实验室ISI的方法，包括了确定直接INR的校准曲线的建立过程。在扩大的指南中，还描述了定标血浆的制备方法和确定INR值的方法。H58-A的目的是在该指南的指导下使进行血小板功能检测的实验室的检测结果取得更进一步的统一。标准对光透射聚集仪（Light Transmission Aggregometry，LTA）、全血阻抗聚集仪（Whole Blood Impedance Aggregometry）、流体切变技术(Shear-Flow technologies )的原理、操作细则、注意事项进行了描述，以便新、老使用者在其实验室建立一致的、可重复的血小板功能实验规程。我国国家卫生部也于2002年制定了WS/T 220-2002 凝血因子活性测定总则，这是一个推荐标准，希望各临床实验室参照执行。标准对参考曲线（reference curve）、参考血浆（reference plasma）、乏因子血浆（factor-deficient）、质控血浆（control plasma）、缓冲液（buffered plasma）逐一作了定义。还明确了测定中所用试剂和材料，包括APTT试剂、凝血活酶、乏因子血浆、参考血浆和氯化钙的浓度，样本收集包括抽血人员要求、病人准备、采血针、采血管、抗凝剂的要求及其比例和采血技术要求，运输和贮存的条件和技术要求。这一系列指南和标准的颁布，进一步规范了各实验室对PT和APTT等凝血因子的测定，使检测结果更为可靠、准确，实验室间更具可比性，更加易于质量控制。
2．纤维蛋白原（FIB）检测及其标准化
目前，FIB的测定方法很多，可分为：（1）基于加入凝血酶后形成纤维蛋白的方法，即功能测定法或可凝固蛋白法；（2）物理—化学方法(热／盐沉淀法、双缩脲法等)；
（3）免疫学方法；（4）FIB含量直接推算法（凝血酶原时间衍生法）等。功能测定法是将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白形成FIB凝块，收集并彻底洗涤后进行检测。根据测量方法的不同又可分为：测重法、酚试剂比色法、紫外光度法、测氮法、浊度法和凝血酶凝固时间法等。von Clauss法是最常用的可凝固蛋白法，其原理为将足够的凝血酶加到稀释血浆中，记录出现FIB凝块的时间，该时间与FIB含量成负相关。该法是一种快速、简便、特异性较好的功能性测定方法，von Clauss 法为国外常规方法；改良Jacobsson法结果准确可靠，为世界卫生组织(WHO)和美国国家临床检验标准委员会( NIBCC) 推荐的参考方法[5]。该类方法测定的是有凝血功能的FIB, 因此最能直接反映血浆中具有凝血功能FIB水平, 所以特异性好。由PT测定衍生的PT—der法，其原理是，当PT测定完成时，纤维蛋白均变成FIB，其形成的浊度与FIB含量成正比，因此无需任何试剂即可由产生的浊度，用终点法或速率法算出FIB的含量。本法精密度相当高，当FIB含量在正常范围或轻度异常时与Von clauss法无显著差异。该方法常用于全自动凝血分析仪的凝血功能检测。而免疫学方法是将FIB作为抗原免疫动物，制成多克隆或单克隆抗体，然后通过各种免疫学方法进行测定[6]。该法的主要缺点是所测的不仅是可凝固的FIB，可能包括了它的降解产物(因为它们有共同抗原)，也可能包括了异常FIB。为了更准确的测定FIB的免疫学特性，相继研制出了FIB亚组份测定、纤维蛋白单体聚合功能测定和FIB基因多态性测定等。血浆FIB在SDS-PAGE电泳时可分为高分子组份纤维蛋白原(HMW、MW340000)、低分子组份纤维蛋白原1( LMW、MW300 000)和2( LMW、MW280000)。许多研究表明FIB亚组份的改变与冠心病、心肌梗死、脑血管病的发生和发展有一定的病理联系, 因此FIB亚组份的测定可能具有重要的临床意义。FIB亚组份测定方法有两类, 一类是SDS-PAGE法，有Mills D 方法和Holm 方法。第二类是利用不同的离子强度的甘氨酸溶液将总纤维蛋白原和HMW分别沉淀，然后计算LMW，常用的是Sasaki 法，Holm法稳定性和准确性较好。FIB被凝血酶作用形成纤维蛋白单体，继而发生聚合形成凝块。观察纤维蛋白单体聚合速率(FMPV)不仅能了解FIB分子对凝血酶的反应性,而且异常时有临床价值。这种测定方法称为纤维蛋白单体聚合功能测定，FMPV、凝固性FIB含量(A最大) , FMPV/ A最大可作为预测心梗和血栓性疾病的有效辅助手段。FIB基因多态性检测的研究，由于相关位点较多，影响因素较多，目前仍处于研究阶段[7]。
3．D-二聚体应用及研究进展
19世纪80年代，科学家就开始了有关D-二聚体（D-dimer）功能及检测的研究，将D-dimer测定作为排除血栓性疾病诊断依据的原创性研究、综述、评论和技术有成百上千项。尽管有大量的文献，但前些年由于D-dimer检测的多样性、变异性，以及实验室间检测的灵敏度和特异性差别较大，未能形成统一的共识。近年来，随着方法学的不断进步，检测技术、试剂的标准化，已明确在各种血栓形成性疾病以及生理性高凝状态和急性时相反应时D-dimer均有升高。凝血反应启动后，凝血酶使纤维蛋白交联，与此同时纤溶系统被激活，降解交联的纤维蛋白形成各种纤维蛋白降解产物FDP及其碎片。其中γ链的交联，产生的包含γ链相连的2个D片段即D-dimer。D-dimer的生成反映机体凝血和纤溶系统的激活，目前认为D-dimer也是急性时相反应蛋白，生理性高凝状态如妊娠，急性时相反应如应急、创伤、感染等情况下也可以升高。在各种血栓形成性疾病如DIC、脑梗死、心肌梗死、恶性肿瘤，凝血-纤溶系统疾病、静脉血栓性疾病等情况下用于排除诊断、病情及预后判断、疗效监测。临床应用中应该注意：静脉血栓形成Venous thromboembolism, VTE)和肺栓塞（Pulmonary embolism, PE）是一个疾病在不同部位的表现，在诊断时二者必须同时考虑以免漏诊或误诊。D-dimer检测对VTE/PET敏感性在82%-100%，但特异性不高仅约32%-52%，故不能单凭D-dimer水平升高来诊断VTE/PET。然而，D-dimer水平正常或低于临界值，患VTE/PET的可能性极小，因此，D-二聚体检测的价值就在于其有高度阴性预测值（99-100%）。D-dimer检测与VTE/PET临床危险度评分结合使用就更加科学、合理，对排除中度/低度危险性的VTE/PET更具有价值。当血栓体积很小或远短小血栓，放射线或超声检查阳性，临床表现与标本采集时间间隔太长(＞14天)，纤溶活性降低D-二聚体阴性患者仍有极少数(＜2%)伴静脉血栓,但D-dimer检测多为阴性。D-dimer检测方法很多，如基于ELISA原理的酶联免疫吸附法、基于胶乳凝集原理的定性或半定量试验以及免疫渗滤法。以上各有特点，ELISA法精确、定量、敏感性高，但操作要求严格且费时，不能满足急诊要求。胶乳凝集法快速简单，但只是半定量，敏感性低，不能完全起到筛查作用，而免疫渗滤法具有前二者的优点，应用前景好。生物梅里埃推出的全自动定量ELISA法，将两步免疫夹心法与荧光标记结合，由VIDAS免疫分析仪自动完成。夏讯生等对胶体金法和免疫比浊法比较后认为,二者均具有较高的重复性、稳定性和线性,可根据实际情况选择检测方法[8]。
4．血小板凝血功能检测及其进展
血小板在动、静脉血栓形成中发挥重要作用。近年来对血小板在凝血功能中的作用，尤其是对其聚集机制有了许多新的认识，从而导致了检测技术的发展。总体上讲，血小板具有黏附、聚集、释放、促凝、血块收缩和维护血管内皮完整性等六大功能。血小板功能检测可分为血小板一般功能测定、血小板黏附、血小板聚集及释放功能的测定和流式细胞术(FCM)分析等。一般性PLT功能测定包括血小板计数、血块收缩试验（CRT）、全血凝固分析法（WBCA）(检测仪器：全血凝固分析仪)、活化凝血时间测定法ACT）（检测仪器：凝血分析仪）、血小板计数比值（PCR）(血小板计数仪)、快速血小板功能分析法（RPFA）等，这些方法是目前临床评价血小板功能的较为常用的辅助手段。
血小板黏附试验：是一定量血液与一定表面积的异物接触后，即有相当数量的血小板粘附于异物表面，测定表面接触前后血小板数之差，可得出占血小板总数的百分率即血小板黏附率。血小板黏附率增高提示血栓性疾病的存在[9]。
血小板聚集功能测定：聚集功能是血小板的另一个重要生理特性，是指血小板与血小板之间的黏附，显示活化的血小板相互作用成团的特征，是血小板参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。血小板聚集功能的测定对于临床上诊断血栓前状态和血栓性疾病具有重要意义。在PRP或全血中加入诱导剂连续搅拌能诱发血小板聚集，聚集反应有两相：
I相：血管壁损伤部位血小板黏附，通过损伤的组织或红细胞释放出ADP所致。特点是聚集发生迅速、可逆即聚集后的血小板又自行分离(称解聚)；
Ⅱ相：聚集是由血小板本身释放的ADP诱导发生的,特点是聚集过程缓慢、不可逆。血小板聚集检测原理是在PRP中加入诱导剂，使血小板聚集，而使血液浊度发生相应改变，根据描记曲线计算出血小板聚集的程度和速度，主要有过滤压力法、比浊法、剪切诱导血小板聚集测定法、散射性粒子检测法、全血电阻抗法、血小板计数法和微量反应板法等。
⑴. 过滤压力法是将全血以恒定的速度通过微孔金属网，若血小板聚集成团，则阻止血流通过，测定过滤前后的压力差来表示血小板聚集活性，此法目前已不常用；
⑵. 富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）比浊法：此法最早由Bron提出，是一种比较广泛的检测血小板聚集功能的方法。血小板的聚集可以由于各种诱导剂与血小板膜受体之间的相互作用,这种相互作用通过膜的传递而激活血小板，使其膜表面另一个受体糖蛋白IIb/IIIa活化,再与血浆中的FIB结合，介导血小板聚集。其主要方法是在特定的搅拌条件下，在PRP中加入诱导剂后，由于血小板发生聚集，悬液的浊度随之下降，根据描记曲线可以计算血小板聚集程度及速度。PRP比浊法临床上主要用于血小板无力症、原发性血小板增多症及血栓前状态和血栓性疾病的诊断。这种方法也存在不足之处：需要去除红细胞，可导致CO2的挥发和pH增高，不能完全反映体内血细胞之间的相互作用；测定时间过长可导致血小板活性降低；对血小板聚集物的形成不敏感，只能检测大的血小板聚集物；离心过程也会导致血小板的激活和红细胞碎片中血小板的丢失；血小板数目的调整难以标准化；重现性差；而且高脂血PRP影响吸光度，减少PRP与乏血小板血浆（PPP）之间的差异。因此，体外血小板聚集实验不能准确反应体内血小板的聚集功能和PLT活化水平 10]。
⑶. 剪切诱导血小板聚集测定法：是该方法采用旋转式铁板流体测定仪，将PRP注入平板的内筒内，氦氖激光透过其中，通过圆锥的旋转产生剪切力，从而引起血小板聚集，聚集的血小板引起PRP透光度的变化，由电脑进行分析处理，最后绘制成聚集曲线。在高剪切力条件下测定血小板的黏附和聚集。该方法简单快捷，不加诱聚剂，血小板在高剪切力环境下聚集，临床上主要用于抗血小板药物的治疗、血栓前状态及血小板功能亢进等疾病的诊断 [11]。
⑷. 全血电阻抗法：1980年Cardina和Flower 以电阻抗原理设计了一种测定全血中血小板聚集的方法，即在测定管中加入2个电极，加入诱导剂胶原或ADP，血小板发生聚集而堆积在电极上，阻抗就相应增加，在记录仪上记录这种阻抗，以观察体外血小板的聚集活性。这种方法的优点是血液无需离心，对于脂血标本的检测,可以克服因浑浊而影响光学结果；全血中的其他细胞同时存在，从而真正模拟了体内的生理环境；保存全部血小板，避免部分血小板因体积太大而在制备PRP时丢失；但比光学聚集仪耗时，对小聚集物的形成仍不敏感，而且每次测定后，电极需清洗干净，同时连接电极的电线需小心安放，不能弯曲。
⑸. 散射粒子检测法：该方法最先由Ozaki 提出，采用氦氖半导激光器(波长为675 nm)通过聚光镜折射成直径约为40μm的激光束，照射到装有PRP的比色杯，利用显微镜的接物镜，使血小板发出的散射局限在一个狭小的范围内测定，通过测定聚集块的大小和生成数量来评价其凝聚功能。血小板聚集颗粒的大小及数量与散射光强度相一致，与比浊法相比，灵敏度有很大提高。
⑹. 微量板滴定法：是用微量反应板酶标仪比浊法测定血小板聚集率。即应用全自动定量绘图酶标仪根据比色法结果得出聚集率。与比浊法比较，该法更灵敏、有效且重现性好，可用于检测已知血小板功能拮抗剂，如吲哚美辛、阿斯匹林等。优点是可以一次可以测定多个样品，尤其适用于临床和科研中对批量血小板聚集率的测定。但是要求血小板计数在一定范围内的结果才比较准确。
⑺. 流式细胞术（flow cytometry，FCM）：随着流式细胞术检测的广泛应用，血小板聚集的检测进入了一个新阶段。欧洲临床细胞分析委员会制定并规范了FCM测定血小板功能的方法学。全血法FCM技术使用全血测定血循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的应答反应。其通过荧光和光散射特性鉴别出血小板后，检测5O00
～10 000个血小板表面的特异性荧光信号。检测结果可用两种方法表示，一种是颗粒的平均荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。与常规血小板功能测定法比,全血法FCM的优点是应用全血简化了标本处理过程，避免了离心导致的体外血小板激活；防止血小板亚群丢失；循环中的血细胞对血小板的活化有影响，因此，本法测定的血小板功能最接近受检者体内环境；可以测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。FCM敏感性高于浊度法，尤其是低浓度的诱导剂更明显。可以检测小的血小板聚集团，因此，FCM 法可能准确地定量评价血小板功能减低患者的血小板聚集功能；它解决了PRP 的血小板数目的调整难以标准化、规范化的问题，不但可以提高检测的精度,还可以分析凝块的大小；结合荧光抗体可同时分析活化过程中血小板表面糖蛋白的变化、促凝微粒的释放、血小板Ca2+的变化等, 同时，使用的血小
板膜特异性单抗检测的仅是血小板而不受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性[12]。
⑻. 血小板聚集仪：血小板聚集率的测定是目前血小板功能检测最常用的指标，常用的比浊法和阻抗法二种，在该类仪器中，设计有可以同步检测血小板腺苷酸释放和血小板钙离子浓度的功能，光电比浊法最为常用，当血小板完全聚集后，吸光度趋于恒定，以透光度增加的百分率来表示聚集程度；电阻法可用全血或PRP进行血小板聚集检测，存在着无血小板活化和亚群丢失的优点，并能反映细胞间相互作用，是比浊法所不及之处，在样品检测杯中插入一对电阻，当全血中的血小板在致聚剂的诱导下发生的聚集，可覆盖在铂电极表面，导致电阻抗的改变，后者的变化程度与聚集程度一致。用于抗血小板药物的治疗、血栓前状态及血小板功能亢进等疾病的监测。
⑼. 血小板功能分析仪(PIatelet Function Analyzer，PFA)：PFA—100和PFA—200系统应用于筛选血小板功能障碍性疾病及抗血小板药物疗效的监测等。PFA利用了Shear-Flow rate原理，于体外模拟血管受伤后初期止血的血小板黏附和凝集过程。PFA检测中使用的一次性反应杯，内有一层膜，膜上有一微孔。孔上覆盖着胶原、肾
上腺素或二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP），当抗凝血从膜的小孔中抽吸出来时，血小板在诱聚剂作用下发生聚集并将小孔阻塞，所需的时间称“封闭时间”（Closure Time；CT）以秒为单位。可检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的血栓性疾病，抗血小板药物检测，血小板贮存障碍、血管性血友病及肝肾功能障碍等疾病。当结果在参考范围内且病史及临床检查均正常时，表示血小板功能为正常,落在参考范围上限以上（prolong）时表示血小板功能低下（不易凝集），若超出极限值300秒，受检者出血倾向高。参考范围：胶原蛋白/肾上腺素（Col/EPI）试验：84-163秒；胶原蛋白/二磷酸腺苷酸（Col/ADP）试验：63-115秒。
其它血小板功能检查
血小板功能检查还有：
① 血小板释放试验，包括致密颗粒释放(血小板ATP释放、5—TH测定)和a颗粒释放(PF4检测、β-TG检测、GMp-140测定)；② 血小板花生四烯酸（arachidonic acid,AA）代谢产物测定，包括血浆TXB2测定、血浆丙二醛测定和尿液AA代谢产物测定；③ 血小板膜蛋白检测，包括PLT膜GPI测定和血小板膜G P Ilb/Illa
测定等；④ 血浆vW因子测定；⑤ 血小板浆内钙离子浓度和钙流变化，有FCM法血小板和激光共聚焦显微镜下血小板浆内钙离子浓度和钙流测定。
5．阿司匹林抗凝监测研究进展
阿司匹林是最早被应用于抗栓治疗的抗血小板药物，已经被确立为治疗急性心肌梗死(AMI)，不稳定心绞痛及心肌梗死(MI)二期预防的经典用药。作用原理是阿司匹林通过与环氧化酶(cyclooxygenase，COX)中的COX-1活性部位多肽链529位丝氨酸残基的羟基发生不可逆的乙酰化，导致COX失活，继而阻断了AA转化为血栓烷A2(TXA2)的途
径，抑制PLT聚集。COXs是AA生成TXA2和前列腺素I2（PGI2）过程中的关键限速酶,在人体内有COX-1和COX-2两种形式，COX-1是PLT固有的。临床研究表明，对各种缺血性心脑血管疾病患者以及其他高危人群短期或长期阿司匹林治疗对预防在随后可能发生的心肌梗死、脑卒中、血管性死亡方面有明确的益处，但在最佳剂量和阿司
匹林抵抗问题上仍存争议。随着对抗血小板聚集药物研究的不断深入，临床面临的主要问题是确定抗血小板聚集药物的疗效和副作用的实验室监测指标。
阿司匹林治疗监测的主要实验室方法有：
① 血小板聚集检测：在血小板聚集功能的检测指标中以比浊法最常用，诱导剂包括ADP（5μmol/L）、胶原（collagen, Col，5mg/L）、肾上腺素（epinephrine, epineph，5μmol/L）、AA(500mg/L）和凝血酶等。不同诱导剂的聚集机制不同：ADP主要是通过与其受体蛋白相结合而诱导血小板聚集；AA完全依赖于在血小板环氧化酶作用下生成血栓素A2（TXA2），进而诱导血小板聚集；胶原和肾上腺素则通过促进ADP释放及TXA2的生成而产生诱导作用。阿司匹林除了可抑制AA诱导的血小板聚集反应外，尚可抑制胶原和肾上腺素的诱导的聚集并部分抑制ADP诱导的聚集[13]。阿司匹林有效者口服75 mg/d或以上剂量,可抑制90%以上AA诱导的、70%左右胶原和肾上腺素诱导的血小板聚集，对ADP诱导的血小板聚集抑制程度依赖于ADP 的浓度。
② 血小板反应指数（PRI）：即Wu-Hoak法，其原理是以血小板原有浓度为100%，在EDTA抗凝的血液中加入福尔马林，低速离心后显微镜下计数血小板和红细胞数，再与原浓度求比值，福尔马林可将聚集的血小板固定。目前常采用全自动血细胞分析仪分别计数其红细胞和血小板，通过以下公式计算PRI:PRI=［血小板计数(EDTA)/
血小板计数(EDTA-4% 甲醛)］×K，其中K为校正系数。K=红细胞计数( EDTA)/红细胞计数(EDTA-4%甲醛)。PRI小于或等于1.25者为对阿司匹林有反应，大于1.05者为对阿司匹林无反应者，此项检测应于口服阿司匹林后12h进行。临床实践证明，PRI在监测阿司匹林疗效
中具有较高价值：
⑴ 可评价阿司匹林在大脑缺血或MI后患者中的疗效；
⑵ 可明确辨别阿司匹林抵抗者与有效者；
⑶ 可监测阿司匹林的使用剂量,区别疾病相关性血栓与阿司匹林剂量引起的血栓[14]。
③ TEG凝血弹性描记仪又称血栓弹力图（Thrombelastograph Coagulation Analyzer，TEG）监测：TEG是能够动态监测整个凝血过程的分析仪。主要用于对凝血和纤溶全过程及血小板功能全面检测（其主要原理及技术下文将进行详细介绍）。目前，国际上已经广泛用于冠心病抗栓治疗、评估血小板活性和抗血小板效果等。检测方法是:首先检测高岭土激活全血的止血活力，然后在肝素存在的条件下(消除凝血酶的作用)通过加入ADP或AA检测ADP或TXA2受体对凝血块形成的作用，然后通过计算处理得到在不同血小板激活剂作用下未被激活的血小板所占的比例，即相应激活剂的抑制率，反映不同的抗血小板药的疗效（ＡA抑制率反映阿司匹林疗效，ADP抑制率反映氯吡格雷疗效）。由于TEG图操作简单、使用全血、测定值的影响因素少，更接近于体内真实情况，因此，可用于评价抗血小板药的临床疗效的监测手段，指导临床治疗[15]。
④ PFA监测：当PFA用于抗血小板药物疗效监测时，胶原蛋白/肾上腺素（Col/EPI）试验小于163秒，表示对阿司匹林治疗无反应；
163-300秒之间表示对阿司匹林治疗有效。目前，由西门子健康保健诊断产品股份有限公司（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH）研发的与PFA-100及PFA-200配套使用的商品化的Col/EPI和Col/ADP检测试剂盒Dade?PFA Collagen/EPI和Dade?PFA Collagen/ADP已经问世。主要用于检测内源性血小板功能缺陷、血
管性血友病（VWD）或服用血小板抑制药物如阿司匹林所致血小板功能障碍。
⑤ 流式细胞术监测阿司匹林抗PLT疗效：正常血小板表面糖蛋白GPIIb/IIIa(CD41/CD61)、CD42、CD42b的表达>95%而CD62P、CD63的表达<3%。而当血小板活化时，CD62P和CD63表达增高，正常时高表达的蛋白降低，另外，血小板表面Pac-1在血小板活化的更早阶段发生变化。阿司匹林可以显著降低血小板表面活性糖蛋白的表达,抑制血小板活化,通过流式细胞仪检测血小板表面PAC-1、CD62p的表达能够监测患者血小板的活化状态及对抗血小板治疗的效果。
⑥ 尿液11-脱氢-TXB2检测：对服用阿司匹林的长期随访发现了约25%的患者存在着“阿司匹林抵抗”(aspirin resistance)或“阿司匹林失败”（aspirin failure）现象，即部分患者虽然长期服用常规剂量的阿司匹林，但实验室检测PLT聚集能力抑制有限。环氧化酶的COX-2存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞和血小板中，被细胞因子等诱导时含量增多，在多种病理情况下作用增强，阿司匹林对COX-1的抑制作用是其对COX-2的作用的170倍，因此推测COX-2活性增强可能是导致阿司匹林抵抗的原因之一。COX-2未被抑制就可以继续诱导生成TXA2，直接测定患者TXA2循环水平是较理想的评价阿司匹林反应的方法，但遗憾的是TXA2在血液中的寿命很短，检测其浓度就非常困难。研究发现TXA2在酶的作用下有很多分解代谢产物，包括11-脱氢-血栓素B2(11-dehydrothromboxaneB2，11-DTB2,11dhTxB2）和11-脱氢-2,3-dinor血栓素B2(2,3DxB2)等。11dhTxB2是TXA2的稳定代谢产物，能被肾脏吸收，由尿液排出体外，在尿液中非常稳定，测定尿液中的11-DTB2水平可反映体内TXA2抑制程度。这一研究成果引起临床医生的极大兴趣，由于11dhTxB2是TXA2的稳定代谢产物，其水平持续升高不仅反映了血小板的COX-1活性未被抑制，还反映了非COX-1途径所产生的TXA2水平，因此，11dhTxB2水平是检测抗PLT治疗抵抗的最有应用前景的方法。近期英国Corgenix Medical Co.开发出一种称为AspirinWorks?的商品化的ELISA试剂盒用于检测尿中的11dhTxB2，新近获得了美国FDA批准用于检测尿液促凝血素代谢。试剂盒采用竞争ELISA，标准物和尿液样本添加至包被了羊抗鼠IgG抗体的孔内，再添加11dhTxB2指示剂和11dhTxB2单克隆抗体，孵育后，清洗孔并添加底物，酶标仪读取吸光度值，光密度与样本或标准物内的11dhTxB2数量成反比。检测时使用晨尿即可，在尿液11dhTxB2检测的同时需测定尿液肌酐值。结果以11dhTxB2 pg/肌酐mg表达 [17]。
⑦ VerifyNow快速分析仪：VerifyNow检测需800ul全血，10min之内检测完成，结果以阿司匹林反应单位（ARUs）表示。测量结果低于550 ARUs代表阿司匹林治疗达到满意的效果，而高于550 ARUs则代表服用的阿司匹林没有达到应有的疗效。
6．ADP受体阻滞剂类与P2Y12受体ADP是使血小板聚集最重要的物质，当血小板发生凝聚反应时被释放，ADP通过血小板膜上的ADP受体对血小板的形状以及生物学行
为产生影响，加速血小板的聚集过程。人类血小板上有三种ADP受体：P2Y1、P2Y12、P2X1。P2X1是钙离子通道受体,对血小板聚集作用很小，P2Y1偶联于Gαq，调节钙依赖的信号转导，引起血小板形状改变和快速、可逆的αⅡbβ3依赖性血小板聚集；P2Y12偶联于Gαi通过抑制ADP产生cAMP来激活αⅡbβ3，这两个受体的相互关系是P2Y1启动聚集，P2Y12起加强作用，是ADP受体阻滞剂的作用靶点。P2Y12在血小板上的表达远高于P2Y1，因此，P2Y12是ADP诱导血小板聚集反应中的主要受体。有研究表明小致密颗粒的分泌，纤维蛋白受体的激活，血栓形成多种途径都可以增强P2Y12受体的作用。P2Y12—ADP受体拮抗剂是目前临床重要的抗血小板药物，主要有噻氯匹啶、氯吡格雷、普拉格雷、坎格雷洛、替卡格雷洛等。对该类药物的疗效评估以往是通过光透射聚集仪（Light Transmission Aggregometry,LTA）。它是将PLT激动剂（如P2Y12受体对应的ADP）加入PRP中，通过测定光透射度判定PLT聚集程度，从而评价疗效[18]。
但该方法受影响因素较多，耗时、费力、需血量大、对操作人员技术要求高、不能大规模常规检测。目前新的方法有：
（1）VerifyNow P2Y12检测：VerifyNow可检测各种主要抗血小板药物，2011年美FDA先后核准了采用全血VerifyNow测定方法用于实验室或急诊测量阿司匹林、P2Y12抑制剂〔普拉格雷(Effient?)和氯吡格雷 (波立维?)〕以及GP IIb/IIIa抑制剂(ReoPro?和Integrilin?)等使用者的血小板抑制水平。VerifyNow P2Y12检测是用于实验室或治疗现场的全血、快速、灵敏、可靠的检测。其基本原理：ADP是血小板聚集的诱导剂,其诱导作用是通过同时激活血小板受体P2Y12和P2Y1而实现的，ADP与血小板受体P2Y12和P2Y1结合能最大限度地活化血小板，而PGE1则抑制ADP诱导的P2Y12介导的胞内钙离子水平的增加。有研究者以P2Y12反应单位PRU值来表示VerifyNow-P2Y12测定结果，则在氯吡格雷治疗后，所有参与者的PRU值平均减少64.0-25.3%,但没有一个参与者达到血小板基数水平10%以下的抑制程度。从PRU值分布看，PRU值基线水平与服用氯吡格雷后测定值出现明显的分离，适用于氯吡格雷治疗过程中监测血小板抑制程度。
VerifyNow全血检测方法简便，样本预处理、全自动操作，定标准确，病人无需停药检测基础值也能准确得出PLT抑制百分比，缺点是仪器费用昂贵[19]。
（2）INNOVANCE? PFA P2Y是与PFA-100? 系统和INNOVANCE? PFA-200系统配套的试剂盒，由西门子健康保健诊断产品股份有限公司研发，用于监测接受P2Y12受体拮抗剂治疗患者体内的血小板ADP受体P2Y12阻断情况。INNOVANCE? PFA P2Y检测试剂盒有以下组分：20μgADP，5 ng PGE1和125μg离子钙〔431μg 二水合氯化钙(CaCl2×2H2O)〕。按照 INNOVANCE? PFA P2Y 测试程序，获得的CT指示测量的样品中的血小板是否存在P2Y12受体阻断。通常，INNOVANCE? PFA P2Y CT≤106秒即视为正常，超过106秒则视为异常，表明PLTP2Y12受体被阻断。评估结果时，务必结合病史、临床表现和其他实验室结果，如全血细胞计数或血小板聚集。
INNOVANCE? PFA P2Y结果与临床评估不一致（如从未接受抗血小板药物治疗的患者获得的CT高于阈值）则应进行其他测试。如果重复测试的 INNOVANCE? PFA P2Y CT仍然小于或等于阈值，则无法检测到 P2Y12 受体阻断，提示P2Y12—ADP受体拮抗剂药物的疗效不理想。目前，INNOVANCE? PFA P2Y仅是根据血小板 P2Y12受体阻断生成分析结果，与临床结果的确切关系尚在探讨中。初步研究84例接受600 mg负荷剂量的氯吡格雷后6 ～24h的患者中82.1% INNOVANCE PFA P2Y CT>106 s（异常）；65例每天接受75mg氯吡格雷7天以上的患者中81.5%INNOVANCE PFA P2Y CT>106s（异常）。
二、几种主要凝血检测分析仪器介绍
随着微电子技术、免疫化学技术、单克隆抗体等技术的迅速发展，1970’s起至今涌现出一系列血液凝固分析自动检测分析仪。仪器生产知名厂家多，产品种多，主要用途各具特色，性能各有侧重。
以下仅就本文相关的几款凝血检测分析仪作简单介绍。
1．全自动凝血分析仪
全自动凝血分析仪目前已成为临床凝血功能检测与分析的主要手段之一。上世纪初Kottman发明了世界上最早的血凝仪，通过测定血液凝固时的粘度的变化来反应血浆凝固的时间。1922年Kugelmass用浊度计通过测定透射光的变化来反应血浆凝固时间。1950年Schnitger和Gross发明了基于电流法的血凝仪；1960年代机械法血凝仪得到开发，1970年代以后，由于机械、电子工业的发展，使各种类型的全自动血凝仪先后问世；1980年代，随着发色底物的出现并应用于血液凝固的检测，使全自动血凝仪具备了凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子检测的功能。1980年代末双磁路磁珠法的发明给血栓与止血的检测注入了新概念，由于其独特的设计原理，使光学法检测的一些影响因素在本类型的检测仪上均不复存在。1990年代免疫通道的开发又为血栓与止血的检测提供了新的手段，基本检测原理包括了凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集
法等，最为常用的仍是凝固法，其中又有光学法和磁珠法两类。光学法凝血仪是根据血浆凝固过程中浊度的变化来测定凝血功能。根据仪器不同的光学测量原理，又有散射比浊法和透射比浊法两类。磁珠法是根据血浆凝固过程中粘度的变化来测量凝血功能。根据仪器对磁珠运动测量原理的不同，又有光电探测法和电磁珠探测法。
全自动凝血仪技术已较成熟，该类仪器的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。全自动血凝分析仪品牌众多，各有千秋，有代表性的全自动血凝分析仪有：1.1 STA -COMPACT 全自动血凝仪及STA-R Evolution系统（图1，2）是两款法国Stago诊断公司的全自动凝血分析仪。STA-COMPACT应用Stago诊断公司专利的摆动磁珠凝固法技术，采用随机模式，同时具有凝固法、发色底物法、免疫比浊法三种检测方法的台式全自动血凝分析仪。适用于常规和特殊止血项目、中等规模的实验室。配有条码识别的STA系列上机试剂，含有包括预定标曲线在内的全面的参数，确保全面和安全的试剂管理。该系统检测凝固法可检测PT、APTT、Fib、TT、RT、凝血因子、Heparin、LMWH、PC、PS、LA、 APC-R等；发色底物法可检测AT-III、AP、PLG、PAI、PC、Hep、LMWH、HCI等；免疫法可检测进vWF、D二聚体、AT-III、Free-PS、FM、B2-GPI等，每项检测均提供STAGO配套试剂。STA-REvolution是全自动立式血凝仪，可连接实验室流水线系统，并可同时随机进行凝固法、发色底物法和免疫比浊法检测。系统独特的样本管理模式和闭盖采样功能（选配）使得仪器具有迅速处理急诊样本，并且不干扰已进行检测和生物安全的特性。STA-R? Evolution采用Windows NT?操作系统，处理能力强，可进行大量的常规和特殊出凝血检测。可设置用户自定义的检测项目，全面的质控，以及和LIS系统双向通讯功能，操作效率大为提高。
1.2 CS-2000i 血栓/止血分析系统（图3）：是Sysmex公司总结迄今为止在血凝分析领域积累的经验的基础上、根据实验室的各种需求开发的“新概念装置”。具备凝固法、发色底物法、免疫比浊法以及凝集法四种检测原理，可全面满足血栓/止血实验室的各种检测需求。在标本处理能力、检测准确性、可操作性等方面均较以前的机型有新的突破。作为最新型号的凝血分析系统，CS-2000i具有出色的灵活性和易维护性，多达10个通用检测通道，提高了多项目组合的综合检测速度。每个标本可任意组合多达60个项目，同时上机检测，同时发报告，对需要多项组合测试的样本能快速得到全面的结果，并做综合分析。50个位置的连续进样器，适合常规标本进样， 5个专用的急诊插入位置，用于急诊标本优先测定且均用采血管直接上机。实现了自动加样、加试剂、自动稀释样本、自动多点定标、自动再检、自动连锁筛选功能。
1.3 ACL TOP家族全自动凝血分析仪（图4）：ACL TOP家族全自动凝血分析仪是美国实验仪器公司（（Intenational LaboratoryUSA，IL）研发的21世纪最新全自动凝血分析仪，包括ACL TOP 700/ACL TOP 700 CTS/ACL TOP 700 LAS/ACL TOP 500 CTS等型号。它集凝固法，免疫比浊法，发色底物法三种方法于一体，检测结果精
确、不增加试剂和耗材、操作系统简便直观、软件功能强大。智能多步骤连锁反应(Reflex Test)，可自动转入29项相关检测项目；平行性曲线分析图，可筛选因子抑制物的存在，因子分析更全面、更精确，实验结果自动核查功能。对特定的临床病例,有特定的异常凝固反应曲线形态。DIC病人早期，无明显临床症状，通过凝固反应形态的特定改变，可提前预报DIC。系统可储存10万条凝固曲线图，16个独立的检测通道，均为双波长671nm及405 nm每个通道可以检测所有的测试项目,包括常规及特殊检测，最快可达720测试/h(同时测定PT和FIB)，D-Dimer 130测试/h。急诊标本随时插入，不中断正在运行中的试验，不限制急诊标本的位置和数量，随时处理急诊样品。
2. TEG： 美国Haemoscope公司（美国海曼斯科公司）专利产品(图5)，是从整个动态过程监测凝血的仪器。TEG于1948年由德国人Harter发明，1980年代开始广泛用于临床指导术中输血, 1995年开始在心脏外科使用，并取得了良好效果，现已成为当今围手术期监测凝血功能的最重要方法。目前以TEG为主要监测手段的体外循环术中凝血监测方案已经在世界上40多个国家使用。我国许多三甲医院的麻醉科、ICU、体外循环、器官移植科等在2000年起用于指导术中成分输血和凝血相关药物的使用，2006年在检验科作为凝血检测的筛选和补充。2007年6月卫生部将TEG试验列入《医疗机构临床检验项目目录》和《全国医疗服务价格项目规范（试行2001年版）》目录中。TEG的基本原理是：承载血标本的测试杯以4°45’的角度和每9秒一周的速度均速转动，一旦血栓形成，置于血标本检测杯中的金属探针受到标本形成的切变力作用，随之出现左右旋动，金属针在旋动过程中由于切割磁力线而产生电流，经电脑软件处理形成曲线。通过测定R时间、K时间、α角度、最大幅度MA、A时间、CI值等，从整体上动态反应凝血和纤溶过程，能对血凝块形成的速度、强度及稳定性以及凝血因子尤其是纤维蛋白原、PLT数量和功能、纤维蛋白溶解等因素进行全面评估。
① R时间：指血样放进TEG分析仪内到第一块纤维蛋白凝块形成之间的一段潜伏期，正常6~8min。主要反映凝血因子、PLT等综合作用；
② K时间：是从R时间终点至描记图幅度达20mm所需的时间（R+K正常为10~12min），用以评估血凝块强度达到某一水平的速率；
③ α角度：是指从血凝块形成点至描记图最大曲线弧度作切线与水平线的夹角，正常为50°~60°，α角度与K时间密切相关，反映血凝块形成及加固的速率，用以评价FIB活性和PLT的功能；
④ 最大幅度M A ： 即T E G 的最大切应力系数( m m ) ， 正常值为50~60mm，反映了正在形成的血凝块的最大强度或硬度及血凝块形成的稳定性，主要受FIB及血小板（质量、数量）影响；
⑤ A时间：是任一时刻曲线两点间的扫描宽度，是血凝块强度或弹性函数，A值用单位mm计量；
⑥ CI（凝血综合指数）：用来反映凝血因子、血小板和FIB综合水平等所有变量的整体水平，数值<-3表示低凝 ，-3～+3之间为正常，>+3为高凝状态。此外还有A60（最大振幅后60min的振幅）、LY30（MA后30min振幅减小百分率）、CL30（MA后30min血凝块溶解剩余%）、TMA时间（从凝血开始至MA值确定所需用的时间）、G值（血凝块强度，即最大切应力强度）、E（是标准化的G，作为一个弹性常数）、TPI（血小板动力学指数）、EPL（预测在MA值确定后30min内血凝块将要溶解的百分比）、TTL（指从MA确定后，曲线幅宽收窄至2mm时所经过的时间）等测量指标。目前该仪器主要应用于凝血因子、纤维蛋白原和PLT数量与质量的定性分析，检测血液中是否有肝素影响、纤溶（Fibrinolysis）活性状态、高凝血状态等，以及判断血栓风险、鉴别术后渗血和出血，诊断DIC，监测体外循环、肝移植手术的出血及凝血状态、心脏介入治疗等的抗凝情况，监测抗血小板药物治疗及疗效、指导成分输血。与传统凝血试验的主要区别是TEG能完整地监测血标本从凝血开始至血凝块形成以及纤维蛋白溶解的全过程。对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等凝血全貌评估，结果不受肝素类物质的影响。
3. VerifyNow分析仪
是美国Accumetrics公司研发的一款种新的POCT分析仪，具有三分钟便可报告结果、简便、精确可靠的特点（图6）。其原理是根据药物作用于血小板聚集激活通路的不同，应用相应的激活剂诱发样本中的血小板聚集，并通过检测光透过血小板聚集后的血液样本的强度，判断出血小板的聚集程度，评估抗血小板药物疗效。抗血小板药物治疗有效，全血样本中血小板聚集能力降低，则样本的透光性减弱；有药物抵抗或剂量不足时，血小板仍能激活并快速聚集，样本的透光性明显增强。VerifyNow分析系统包括仪器部分和一次性单一用途的试剂仓，试剂仓含有双化学试剂—激动剂和纤维蛋白原包被的粒子，根据激动剂的不同，进行特异性分析。图7是VerifyNow试剂仓的示意图[20]。当柠檬酸抗凝全血试管插入试剂仓后，全血与血小板激动剂和纤维蛋白原包被的粒子通过电磁驱动的钢球的运动混合；当药物未能起到恰当的抑制作用时，血小板就被激动剂所激活，结果激活的血小板与纤维蛋白原包被的粒子结合从而导致血小板聚集，并且从液体中沉降。VerifyNow通过每秒16次测定通过样本的光吸收，获得血小板诱导的凝集率和程度，通过公式计算出报告值。目前与VerifyNow配套使用的商品化的试剂盒有三个：即AA、ADP、GPⅡb/Ⅲa，分别对应VerifyNow阿司匹林试验、
VerifyNow P2Y12试验和VerifyNowⅡb/Ⅲa试验，用以评价阿司匹林、P2Y12抑制剂（例如普拉格雷(Effient?)和氯吡格雷 (波立维?)）和 GP IIb/IIIa抑制剂 (例如ReoPro?和Integrilin?)的抗血小板疗效。
4. INNOVANCE? PFA-200分析系统
INNOVANCE? PFA-200分析系统可对血小板功能进行简明、快速和精确的定性分析（图8）。利用少量全血样本（800μl）5-8min内检测血小板栓塞情况。基本原理是：通过流式技术，于体外模拟血管受伤后血小板黏附和凝集过程，为原发性止血的检测提供了逼真的血液动力学环境。系统由若干集成部分构成，包括毛细管、样品池和带有中央圆孔的生物活性膜（如图9示意图）[21]。柠檬酸钠抗凝全血通过毛细管和中央孔从样品池吸入，使血小板曝露于高剪切流条件。在PFA测试开始时，向膜上加触发溶液(Trigger Solution)以溶解ADP、钙和前列腺素E1（PGE1）。在测试过程中，血小板在高剪切力作用下附着于膜上，通过与膜和溶解的试剂相互作用，血小板被激活，释放出其颗粒成分，并开始凝集，形成血小板凝块，致使中央孔逐渐缩小，并最终阻断血流。PFA系统测定从测试开始到中央孔阻塞的时间，并将该时长报告为CT，用来分析全血样品中的PLT功能指标。系统配备的软件支持系统进行各种分析，闭合曲线分析可用于科学研究。可用于遗传性、获得性或药物诱导的血小板功能紊乱的判断，用于明确
术前病人应用醋酸去氨加压素的有效性及术前出血危险性，用于评估阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂等抗PLT药物的疗效。INNOVANCE? PFA-200分析系统有与之配套使用
的专用试剂盒：（1）胶原蛋白/肾上腺素检测盒（Dade? PFA Collagen/EPI Test Cartridge）用以检测由内在PLT缺陷、类血友病或抗血小板药物所介导的PLT功能障碍；（2）胶原蛋白/ADP检测盒（Dade PFA Collagen/ADPTest Cartridge）主要是用以评估PLT功能异常是否为阿司匹林或含阿司匹林药物所引起，并能对阿司匹林抗血
小板作用进行检测，进而评价患者阿司匹林是否抵抗；（3）INNOVANCE? PFA P2Y检测试剂盒：用于检测氯吡格雷等 P2Y12 受体拮抗剂对血小板 P2Y12 受体阻断
情况。Dade? PFA Collagen/EPI Test Cartridge和Dade?PFA Collagen/ADP Test Cartridge目前已商品化，而INNOVANCE? PFA P2Y检测试剂盒正在申请FDA认证，在美国尚未商品化。目前正在开发和研究的血凝分析相关仪器及技术非常之多，例如血栓鉴别分析仪〔C l o t S i g n a t u r e A n a l y s e r ( C S A ) 〕、血栓状态分析仪〔T h r o m b o t i c S t a t u s Analyser(TSA) 〕、高剪切滤过仪和锥板分析仪等。这必将进一步推动临床出血和止血（血栓）的诊断和治疗。
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