生化应用方面的一些知识

前面写过“生化分析仪维修有关的基础知识”（https://www.yeec.com/forum.php?mod=viewthread&tid=38682），那是针对维修人员的基础培训，而应用问题也是生化分析仪日常工作中的老大难，甚至可以说头疼的问题。所以本帖就以方法及参数有关的知识简略概述一下：
1、导向知识：生化分析仪的基本原理是分光光度计，或者俗称比色计。分光光度计的依据是“朗伯—比尔定律”。
朗伯—比尔定律阐述了液体吸光度与液体浓度的关系，并且引申出相应的公式及推导公式。
吸光度越高，溶液的色度也就越深，反之越浅。当然前提是同波长下。
一般来说，生化反应把吸光度增加的叫做正反应，或者叫做上升反应，色度越来越深；吸光度下降的反应叫做负反应或者下降反应，色度越来越浅。
应用和维修的界限其实很难划分，一般来说操作问题属于应用，故障属于维修。但结果问题有可能是应用问题，也有可能是故障，所以生化仪区分应用和维修我认为纯属找麻烦。
2、生化的测试方法：从分光光度计的方法来说，有透射和散射两种方法，生化仪只用到透射法，因为它只有一套光路。贝克曼的自有机型和特定蛋白仪及免疫类血凝类设备，还增加有散射法等等。
生化的测试方法只有两种，那就是终点法和速率法，其余方法都是衍生法。
而单试剂或者双试剂与否与方法关系不大，只跟衍生法有关。
2.1 终点法顾名思义，在反应终点进行吸光度测定的方法，其衍生方法有一点终点法，对应单试剂；两点终点法对应双试剂。还有一些相关的概念：试剂空白、血清空白。
先声明一下，下面出现的所有例图都是选自日本、奥林巴斯、东芝、拜耳这些生化仪的手册，选择的目的一是有代表性，而是清晰度好，并非我个人有所倾向。
2.2 一点终点法：也就是单试剂采用的方法。


这是奥林巴斯的曲线示意图，它是R1+S方式，所有生化仪都是以样本S的加入为正式读点的开始，之前加入的试剂读点都为0或负数。所有试剂和样本加入后，都进行搅拌。
上图中R1加入搅拌后进行第一个读点吸光度测试，读点编号为0，然后加入样本再次搅拌开始正式读点1-27。而测试读点是27，也就是反应终点。当然，不一定非要到最后一个读点，很多蛋白反应速度很快，几分钟就到达终点，所以根据情况设置。
奥林巴斯的机型算是一类机型，与贝克曼自有机型类似，R和S间隔读点，也正是这个特性引发了试剂空白和血清空白的应用。
而日本的机器代表着另一类机型，那就是S+R方式，但S和R在同一圈内加入，所以读点从1开始，没有0也没有负数。如下图：


从上图可以看出，第一点已经开始反应了，没有奥林巴斯机型那样有个平坦的水平线。这个图例反应时间比较长，直到30以后才趋于平稳反应终结，所以读点算在了33-34点。也就是最后两点。
上面两例都是一点终点法，日本的机型无话可说，它就没有平坦区域，那么奥林巴斯的呢？是否可以在平坦区域，也就是R加入后去一个读点，将空白扣除掉，这样结果不是更精确吗？
话可以这么说，事情不能这么做，因为一点终点法都是以反应终结的吸光度为准的，不能出来第二个点，何况机型不同，有的你就出不来第一点。
那么在上面两张图里，大家都看到，反应的起点都不是Y轴的0点，可能大于0也可能小于0，单纯的终点吸光度减去起点吸光度仅能适用于一点终点法。
所以奥林巴斯机型把R加入后的平坦区域，叫做试剂空白，这没错，这段区域只有R参与，根本没有任何样本。但它并不在测试时增加一个空白读点，而是在测试准备或定标准备前增加了一个试剂空白测试。试剂空白检测完毕后，数据保存在数据库里，在更换试剂之前，试剂到期之前都采用这个数据作为空白值参与结果的计算。
试剂空白有一定的范围，超过这个设定范围会认为试剂失效或者污染，所以在奥林巴斯的机型里，试剂空白是一定要做的，而且间隔时间不能太长，否则会报错。
除了试剂空白外，还有血清空白，因为血清的底色甚至高于试剂底色。所以在一点终点法中，为了得到精确的结果，也要进行血清空白的测试。要注意的是，这个方法很少使用，因为要测定血清空白需要单独的通道。也就是说一个样本要被测试两次，一次是常规的反应，加入R进行测试，另一次是单独采集样本，不加入试剂，而加入生理盐水或纯水稀释到前一次的稀释比例，单独测试样本血清的吸光度。然后将终点反应的吸光度减去血清空白，得到的结果才是反应结果。如下图：


2.3 两点终点法，也就是双试剂常用的终点法。
在奥林巴斯机型中，双试剂会出现两个或三个平坦的区域，R1加入之后，和S加入之后，如果是终点法，会在反应终点还会出现一个。如下图：


那么两点终点法除了在27点读一个之外，还要在10点读一个点，也就是在R2加入之前读一个点。这样反应吸光度值就等于终点吸光度值减去试剂样本空白，注意是试剂样本空白，不是试剂空白，所以这个点只能在S之后，R2之前。惯例一般在R2之前的一个点，而不是R2之前S之后的任意点。
下面是日本的图例：


由于是S+R1，所以曲线开始就进行反应，除去杂质消除干扰，直到R2加入前趋于稳定。16点之后加入R2，正式反应启动，直到27点趋于稳定，所以终点读点选在33-34上。而试剂样本空白选择在15-16上。
从日本的图上我们可以看出，如果选择一点终点法，那么反应的吸光度值应该是137，而去除试剂样本空白的两点终点法的反应吸光度值呢？应该是-（137-477）=340，可以看出后者更为精确。
说明：如果是正反应，吸光度值等于终点值-试剂样本空白值；如果是负反应，吸光度值等于终点值-（-试剂样本空白值）。这就是为什么要告诉反应方向的原因，否则算出来是负的结果没法报了。
总结：一点终点法适用于单试剂，两点终点法适用于双试剂，但第一点要在R2之前的一点。
2.4 速率法：使用最小平方法计算两点间的吸光度变化，确定每分钟吸光度的变化率，也就是ΔOD/min。
常规的速率法是在R2加入之后，给出两个读点，系统根据两点间的时间，自动计算每分钟的吸光度变化。下图是奥林巴斯的图例：


下图是日本的图例：


可以看出上图读点范围是22-28点。
采用常规速率法有个前提，那就是R1加入之后前期反应趋于稳定，比较平坦，加入R2之后迅速启动反应，形成斜线，读点范围取在斜线上。
如果R1加入之后也是斜线，那就要使用双速率法，也就是在试剂样本空白的斜线上取一段进行空白速率计算。


双速率法很少使用，与常规速率法的结果比较差别也不是很大。
在日本机型中，常规速率法叫速率A法。日本多了一个速率B法，那是双项目检测的，没有专用试剂无法实现。
图例中的速率法每点线性都很好，但遇到每点线性不好的，就会报错，结果被拒绝、屏蔽。线性不好一方面是试剂质量问题，另一方面是反应特征，无法保持线性。那么这种问题各个厂家也都有对应，日本叫做两点速率法，奥林巴斯叫做固定点法。
2.5 两点速率（固定点）法：确定特定两点间的吸光度差值，无线性甄别。


还有引申出来的双固定点法，对应双速率法：


上面两图都是奥林巴斯的，下面是日本的两点速率法。


2.6 终点法和速率法的运用不能混淆，什么项目用什么方法一般不会有错，试剂厂家的说明书上都有明确介绍，一般不会搞错，但也有例外，下图就是一个例子，是小东版主的讲义节选的。
例1：故障现象是TBA结果总是出现负值，而且更换过试剂，定标都通过，仍然解决不了。
曲线如下：


方法采用的是两点终点法（R2之前之后各一点），这是致命的错误。根本找不到终点的曲线，怎么能使用终点法呢？
再来看看负值是怎么来的，TBA是正反应，如果采用两点终点法应该是后点-前点。左图后点高于前点，所以是正值；而右图后点低于前点，减出来肯定是负值。但方法错误这个前提已经确定，后面再怎么分析也没有意义了，明显的速率法。
读点问题最常见，这也就是结果问题要曲线的原因所在。
例2：这是群里的一个问题：高低密项目定标和质控都没有问题，就是病人结果偏低。这个无法直接回答，还是上曲线看看吧。


两张图传完就明白原因了，读点错误。高低密采用两点终点法，而两点终点法的关键是R2之前一点，另一点在反应的终点。而图上明显是两点都在R2之后，再分析为什么会结果偏低，以第一张图为例。
这个机器是R1+S方式，R1加入后吸光度在400上下，比较平稳，紧接着加入S，吸光度升到1000左右，加入R2之后，反应终点区域大致在1300左右。如果是R2之前一点为1000，R2之后反应终点为1300，那么两点终点法的反应吸光度为1300-1000=300，据此计算浓度。而图例中两点都选择在了R2之后，第一点的吸光度大致在1300左右，第二点也是1300左右，二者相减相差无几，搞不好还是负的，难怪结果低了。
有一点我很不理解，生化仪的软件设计人性化方面有问题。既然选择了终点法，你就不该让操作人员设置读点的时候把第一点设为R2之后，干脆报错提示多好呢？
2.7 速率法的底物耗尽问题。所谓底物耗尽，就是样本浓度太高，试剂提供的反应物质迅速反应完，而样本中的检测物质还有很多没有参与反应。通俗的话讲，就是在速率法的反应中看到了终点法的曲线。下面是图例，也是小东版主的讲义：


图例中看到的是典型的日本速率A法，见到这样的图，结果肯定偏低甚至为0或者负值。这样的图首先应该想到方法是不是错误，如果速率法没错，那就只有一个可能，底物耗尽。几乎所有的机型都提供危急值报警和自动重测，遇到这种情况，一般都采取自动或人工稀释重测的方法解决。而东芝及其OEM机型雅培的生化仪，还有日电及拜耳的机型，可以自动进行判别，并将读点前移。东芝叫做弹性速率法，日电叫做读点前移。概念是这样的：
以上右图为例，速率法选择的主读点区为22-28，并加以吸光度判别和线性判别，当出现底物耗尽时，这个主读点区的线性几乎停滞，吸光度变化降低到几乎为0，这种情况下启动弹性速率读点区，一般设置在R2加入后10点以内，比如选择在17-21这个区间里。在弹性速率区间里进行速率法计算，从而得出一个较高的浓度值，因为这一区间反应速度很快。
这种方法以前有很多医院的老师作过实验并发表过论文，与手工稀释的结果比对，符合率高达96%。这样一来，省工省力，节省了医院最为看重的成本。
下图是官方的弹性速率解释和读点前移介绍：



总结：速率法的读点都在R2之后，两点速率法或固定点法不检查线性，底物耗尽要看曲线。
3、生化的定标方法：定标方法分为线性定标和非线性定标，也就是俗话说的直线定标和曲线定标。生化中大部分项目都是用线性定标，而非线性定标大多用在免疫比浊项目上。
3.1 线性定标。我们都知道，两点决定一线，所以要定标最少要有2个定标点。定标的概念是在直角坐标系中，以浓度为X轴，吸光度值为Y轴，通过校准点的XY轴对应关系，将直线确定下来，标本测试中所有的吸光度值都能在这条直线上找到对应的浓度值。如下图所示：


图中给出的STD1、2两点是定标液，无论它们的吸光度值是多少，都会有一个确定的浓度值赋于它们，那么在直角坐标系中，这条定标曲线就被确定下来，无论样本的吸光度值是多少，都能在这条线上找到对应的浓度值。
同时我们还能看出，这条直线是这个第一象限的角平分线，也就是45度的倾角。这种定标的结果保证了很宽的线性范围，无论多高多低都会有良好的线性。如果这个倾角大于或小于45度，那么在宽泛的测试中，吸光度的变化与浓度的对应就不能好计算了。所以很多高值或低值结果不好，而且又是线性定标的话，就要看看定标曲线是不是45度的倾角，如果不是，就要考虑定标问题了。
那么定标的直线是怎么来的呢？根据直线方程而来，也就是一元一次方程，Y=AX+B。Y是吸光度值，X是浓度值，A是因数，B是截距。因数也被称为斜率、K值。
再通俗的讲，A其实就是这条直线的倾角，B是X=0的值，也就是直线与Y轴的交点。
所以得到这条直线的方法有三种：
I、假设直线过原点，也就是B=0，那么只要给出A的值，直线也就可以得出。当然如果要想得到45度的漂亮曲线，至于要将A=1即可，也就是Y=X。这个A大部分时候要乘以10000，这是一个换算因素。也就是很多厂家给出的K值是1万多，8千多等等的原因。这就是常说的K因数线性定标法。
II、假设直线过原点，也就是B=0，那么只要有一个非零点的值，就可以得到整条值线。因为第一个值已经确定，那就是Y和X都是0，也就是原点。这就是常说的一点线性定标。
III、给出两个定标点，让机器自己计算直线是否过原点，这就是两点线性定标。
我们可以看出三种方法前两种都有一个前提，那就是假设直线过原点。那么到底这个项目是否过原点呢？我们并不肯定，所以I、II两种方法都有缺陷，不太靠谱。特别是I种方法，无法得知厂家给出的K值是怎么来的，如何界定准确与否。
下图是因数K值定标和假设过原点的一点线性定标示意图：



所以推荐的方法，也是不出错的，最为准确的方法是III，两点线性定标。在两点线性定标中，大多数时候是给一个标准点和水点，水点的意义是给一个零浓度的点。这样一个零浓度，一个有浓度，两个点决定一条直线。当然，零浓度点也可以用带有浓度值的标准替代，无论如何只要给两点就能决定一条直线。下图就是示意图：


K因数法定标虽然不靠谱，但大多数医院特别是小医院还是喜欢用，因为毫无成本，不需要校准品。但也正是因为这样的不靠谱，导致所有采用这种方法校准的项目，结果往往出现高值不高，低值不低，甚至与其它机器无法做出准确的对比。
假设过原点的定标又叫一点线性定标，只需要一个校准品即可。但有一个问题，你确信它绝对过原点？如果不过原点，那么就存在一个截距，结果总是差那么多，又不能改系数，非常别扭。
在日本机型上，三种线性定标的方法分别称为1点定标（K因数法），两点定标。东芝和拜耳与之类似。
在奥林巴斯的机器上ACAL AA法针对的是两点线性定标，给出两个浓度点（其中一个可以是零浓度）自动进行直线矫正，自动判断是否过原点。而ACAL AB则是假定过原点，再给出一个浓度点即可，也就是一点线性定标。MCAL MB法则是K因数法。
奥林巴斯经常出现结果不准的问题，很大程度上与定标方法的选择有关，大部分都选择ACAL AB或者干脆使用MCAL MB。抛开K因数法的MCAL MB，单说ACAL AB。其实我们无法得知这个项目或者这个试剂是否真的过原点，是否总是过原点，因此ACAL AA是最佳的选择，因为并不增加成本，只是给一个水点，也就是零浓度点罢了。
由于奥林巴斯机型软硬件设计上的特点，把简单的定标搞的云山雾罩的，特别是几种颜色的架子，把人们搞糊涂了。而且很多人把试剂空白和水点混为一谈，造成定标方面的诸多问题。
试剂空白是奥林巴斯机型必须要做的，为了保证结果的准确，在测试吸光度上减去试剂空白是正确的。而试剂空白并不是零浓度点，两个完全不同的概念。试剂空白是各个测试都要参与的，零浓度点只在定标时使用。虽然二者使用的样本都是水。
奥林巴斯机型中，蓝色架子是试剂空白，这个在测试前要先放入进样器，紧跟着是定标用的黄色架子。我们一般都采用多项目定标液，一瓶定标液可以定标多达20几个项目，这20几个项目用这一瓶定标液就可以搞定了。当然多点定标的免疫比浊项目不行，是单独的定标液。
黄色架子的第一个位置要放纯水，告诉电脑这是零浓度点，也就是第一定标液。第二个位置才放多项目定标液，告诉电脑不同的项目的值是多少。
其后才是放置质控品的绿色架子和常规样本的白色架子。
很多时候由于定标液太多，特别是开了不少多点定标的项目，一个黄色架子排不完。那就多排几个黄架子，如果没有，就一个黄架子，那就多走几遍。第一个黄架子之后跟着第一个黄架子有关的质控绿架子，然后测试，就不要放白架子了。这一遍走完，把没有做的定标液换上，再跟与之有关的质控绿架子，再来一遍，直到定标和质控完全走完再走常规样本。
很多定标问题都出现黄架子的第一个位置是定标液，根本没有水点，理由是前面的兰架子做了试剂空白了啊？！这是典型的误区。还有的不放水点的原因是黄架子位置不够了，没法做。这是不是理由的理由，搬家一次搬不完不会分两次啊，一口吃成胖子不成？
总结：线性定标最好选择两点，其中可以包括水点（零浓度点），坚决摈弃K因数法。
3.2 多点线性定标：很少用，我也不知道什么项目会用到。两点决定一线了，还要那么多点干吗呢？只知道同工酶法是多点线性，但如何应用并不清楚。不过存在必有道理，我孤陋寡闻罢了。
3.3 非线性定标。针对线性定标的直线来说，非线性定标肯定是曲线，曲线的趋势不同，决定了不同的结果走向。非线性定标最少需要2个点，但一般最少选择4个点，否则曲线难看不说，结果也做不好。非线性定标大致分为对数（logit）曲线，折线（polygonal），指数（exponet）曲线和样条（spline）曲线。
下图是对数曲线


下图是样条曲线：


下图是折线


下图是指数曲线


折线和指数曲线很少使用，我还没在应用中见到过用这两种曲线的定标项目。
奥林巴斯和拜耳把所有的非线性定标都认作是多点定标，至于曲线趋势根本不管你是对数还是样条，只要你给我定标点，我就给你画出来，然后再定标曲线上查找对应的值。
但奥林巴斯的多点定标又有ACAL和MCAL之分。ACAL n（2-7）AB是自动进行多点定标，最少要有2个点。但这个软件人机对话方面有些问题，按理说按照日本的设计，多点定标分那么种，你都给罗列上不就行了吗？不，奥林巴斯分了两步进行输入，首先输入定标类型，也就是多点定标还是单点定标，线性还是非线性，自动还是人工。然后在后面紧跟着一个公式选择，让你选择计算公式是直线方程还是对数、折线、样条等等方法。这下把操作人员又搞糊涂了。


上图是多点定标的曲线，看起来也是对数曲线，下图是定标设置的参数屏幕


前面的红圈是选择定标方式的，多点定标的话最少要选择2AB以上，图上是5AB，也就是5个定标点。后面的红框是选择计算公式的，图上选择的是折线（polygonal），但是很明显，CRP用折线很不合适。前面的定标点选择也就是定标方法选择很少出现问题，有几个定标液大家都知道，往往是后者公式选择错误，造成定标质控还可，结果一塌糊涂，特别是高低值的标本。
我还真记不住公式里面都有什么，记得有直线方程，折线，样条，对数和指数。
再看上图，CRP的5个定标点没有水点，也就是说没有零浓度点，那么系统会默认从原点开始。这就是很多人做出来的非线性曲线在最低浓度处会出现一个怪异的扭曲的原因。
而奥林巴斯的MCAL n（1-7）MB是人工多点定标，与自动多点定标的区别是人工多点定标认为是折线，每一个线段都有一个斜率，做不出曲线来。所以这一点也要注意。


对数曲线大家都很数学，中学学习对数的时候没少折腾，俗称抛物线。日本和东芝把对数曲线分的很细，有LOGIT-LOG3P/4P/5P等，分别代表不同的对数趋势，所用的定标点都一样，2-6个。

Log3P的趋势图


Log4P的趋势图


Log5P的趋势图

从这里可以看出不同的Log趋势，对相应高低浓度的吸光度对应有着不同的对应，所以在方法没有错误的情况下，结果高值不高，低值不低，甚至相反的时候，可以在这些机型中找到对应的曲线趋势进行重新定标。
有人说只要是多点定标就采用样条Spline，这仅仅是大多数而已，也有特例的。对数与样条曲线的差异还是很明显的。一般来说，除非厂家明确给出定标方法，如果没有给出，多点定标先选择样条曲线进行定标，定标后观察曲线，人工判读是折线好，还是对数好，还是就是样条。对数的话还要看是哪一种对数。要有一个人工判读修改的过程，不能什么都交给机器，机器毕竟是死的，你告诉它什么，它就认为是什么。
多点定标中，理论上讲应该倍比稀释，也就是说厂家发来一瓶定标液，要倍比稀释5份，加上一份水点，按照浓度从低到高的顺序加入测试进行定标。这也是最经济的办法，毕竟一瓶定标液的价钱在哪儿摆着。
例如一瓶标有浓度为40的定标液，倍比稀释加上水点后的浓度依次为0、2.5、5、10、20、40，这样做的定标方法可以直接选择样条曲线。但也有很多厂家给出了五种定值的校准品，而且并非倍比的。相邻定标值不是两倍关系，甚至多达几十倍的关系，这样做的目的无非是要拉宽测试结果范围，能做出很高的值来。但是这样一来，超高值的可靠性就很令人怀疑，而且肯定做不准的。我听到过很多人对此的解释是反正已经超高了，准不准的意义不大。
唉，这也是国情所在，毫无办法。老老实实做事的，被冠以结果范围太窄，稍微一高就做不出来，要人工稀释才行。而这些用这种方法做出来的，根本无人管结果准不准，只要是能减轻他的工作强度就行。
如果采用了多种定值校准品，而且不是倍比关系的，就不能采用样条方式，在对数曲线里找一种合适的吧，或者看看指数函数是否适用。
一味拉高定标值也源自机器设置，超过定标最高值，就不出结果，提示超过定标值，这样引起操作人员的不满。唉，稀释啊，都有LIS，稀释后传到LIS上，在LIS上修改一下结果。但这会加重操作人员的负担，哪怕是计算器算一下，手工稀释一下，再做几遍的时间。
一般遇到多种定值校准品校准后结果出现问题的，我都要求用最高值倍比稀释重新定标，方法还是采用样条曲线。而且多次试验证明，用最高值倍比稀释后，再重测其它四种定标液，得出的数值有的相差甚远，厂家当初给的值就不准，怎么能保证结果的准确呢？
总结：多点定标别忘了水点，倍比稀释才能保证结果准确，在无法判定方法的情况下，先采用样条曲线，然后人工判读修改。
3.4 在定标中，有很多检查需要注意。如空白吸光度，每一点的吸光度范围检查，线性检查，灵敏度检查等等，如果设置了这些检查，那么超过这些检查值就会报错，定标不会通过。同样，通过了这些检查的定标肯定是值得信赖的。如果不想进行检查，要想定标顺利通过，那最好取消或者将这些值放到最大。这样做定标虽然会通过，但准确性大打折扣，自己心里都没有底儿。
定标后的校正问题：定标后特别是多点定标后，对曲线不满意，或者样本结果不满意，可以采取重新定标（也叫全点校正）或者单点多点校正方式修正定标曲线。通俗的讲就是取其中一个点或一两个点进行定标，从而修正整条曲线的方法。
采取这种情况，一般是多点定标液的一种或几种用完了，或者只有其中的一两种的情况下。除非必要，否则真的没理由采取这种方式。
下面的图示是奥林巴斯的单点校正示意图


下图是东芝的单点和两点校正示意图


说白了，就是根据原来的曲线趋势，任意改变其中的一点或两点，自动进行其余点的浓度计算，从而修正整个曲线。
我有个朋友是做应用的，他最喜欢干的事情是做单点或两点校正，认为这样省事省力。但经常出现结果还不如从前呢。于是乎我下班回家做饭，这位老兄下班呢到我家吃饭，然后就写写画画，分析今天的单点校正为什么不行，昨天的两点校正为什么那么怪异。我的反应一向很慢，在数据不充分，没有查询的情况我很难得出一个令我自己信服的结论。我信奉一个原则，那就是省事儿就是费事。所以我从不做单点或两点校正，而是全点重新定标。每次看到老兄给我的曲线及后面的校正图后，都能找到相应的校正点，而不是他选择的。也就是说出问题的点不是他修正的那个点。这个判断很难描述，特别是在没有案例曲线的情况下。这位老兄也云山雾罩，死活不理解我的判断。后来，大概半年后，这位朋友彻底抛弃了单点或多点校正的方法，改为老老实实的全点定标，真正的省事省力了。

4、新上项目:在新开展项目之前，需要进行参数的设置。而在参数设置之前要做下列准备工作：
a、准备试剂、校准品（定标液）和相应的质控；
b、准备微量样本杯，分配校准品和质控品；
c、准备试剂说明书、相应的上机参数；
d、翻看仪器的操作说明，登记项目、试剂及校准品的名称、位置、容量、有效期等信息。
e、参数录入
f、进行校准和质控，判断校准数据、校准曲线和反应曲线是否符合反应趋势，进而修正参数的部分细节。判断质控是否在控。
g、样本测试，进行重复性验证和线性验证。
4.1准备试剂、校准品和相应的质控：如果对溯源要求很高，那当然是封闭型设备的原厂试剂原厂质控校准品，省心省力。而第三方试剂、校准、质控，也能溯源，只不过麻烦些而已。很多医院增设新项目，选择第三方试剂的原因就是考虑成本问题。最怕的是试剂、校准、质控是三个不同厂家的，不用说溯源，就是保证结果都不容易。一般的组合是试剂厂家提供试剂和校准品，采用第三方质控；或者试剂厂家只提供试剂，校准品和质控品为另一个厂家，比如朗道的，这样会多少好一些。
准备的试剂、校准品和质控品一定都要有效期内，而且是未开封未复溶的产品。已经开封使用过的，暴露在阳光下常温下不知道多久的，最好别用，说不清楚。质控和校准品一般都是干粉的，先复溶使用。很多医院把校准品和质控品复溶后分装使用，这在新上项目上最好别这么做，不能处处都说不清楚，能说清楚的还是说清楚。
4.2 准备微量样本杯，用来分配校准品和质控品准备上机使用，尽量不要使用子弹头离心管。很多采用离心管的，造成撞针情况的不少。因为校准品和质控品是当做样本，放入样本盘或样本架上的，大部分机型能自动扫描并识别样本类型，是试管还是样本杯，这样就会指导样本针下降高度和判断液面的开始时间。而离心管无法直接放到样本盘架上，只能插入试管上，让试管当托架，这就容易造成误判。机器认为是试管，那么就会按照试管的标准指导样本针下降，并按照试管的液面探测时间开启探测，结果因为离心管的存在，导致行程根本没有那么大，液面探测还没有开启就已经撞针了。严重的会导致样本针弯曲折断，还有的会扎漏离心管，让人惊心动魄。
当然，有些机型的某些设计是允许离心管直接放入的，比如东芝的TBA120FR，它的C/C盘就可以直接放置1.5ml的离心管。但要注意，能够直接放置离心管的机型，一定要把盖子去掉，否则盖子回弹，一样会撞针。
4.3准备试剂说明书、相应的上机参数：每个试剂盒里都有试剂说明书，里面涵盖了很多内容，包括：名称、规格、用途、成本、有效期及存储条件、适用机型、样本要求及方法。除此之外还有性能指标、注意事项等等，当然还有最为重要的注册证号、标准号、厂家及联系方式。
在使用方法里面，会告诉你波长选择、方法及方向，然后是试剂配比的操作方法。要注意的是，这里给出的试剂配比是指手工法的，配比之后上分光光度计读数，然后根据后面给出的公式自行计算的方法，并非上机参数。按照这个配比比例，根据不同机型的反应杯最小和最大反应容量可以自行按照比例计算上机参数的试剂量和样本量。
几乎每个试剂厂家都提供不同机型的上机参数，当然也有例外，那就是新出的机型，或占有率较少的机型，厂家还来不及准备。上机参数比较直接，对应机型和项目，直接录入进去就行了。
下面举一个例子，厂家就不提供了，只是说明问题：
项目名称为TBA，也就是总胆汁酸。厂家的说明书部分截图如下：



前后都有省略，说明问题罢了。
由这张说明书上，我们可以看到TBA的方法是速率法，递增（上升）反应。主波长为405nm，副波长为660nm。样本量为20ul，R1量为1350ul，R2量为450ul。不仅有样本的配比，还有标准品的配比，当然二者一样，除此之外还有空白的配比。手工法空白要单独做，用蒸馏水替代样本，测试的是试剂空白。这在很多的机型中自动完成。
而在这个厂家的上机参数里，是这样描述的，机型是TBA120FR：


这并不是现在我们看到的TBA120FR的界面，而是老式的，并且没有分页，直接罗列。所以在输入的时候，对应英文选择性输入。
首先我们看到手工法和自动法的试剂配比关系，也就是试剂说明书和上机参数之间的关系。
说明书的配比关系是：样本量为20ul，R1量为1350ul，R2量为450ul，上机参数的配比关系是样本量为3ul，R1量为200ul，R2量为66ul，几乎就是20:3的关系。所以只要按照比例关系，几乎可以任意设置。
那么反应杯的反应总量上下限与试剂配比的关系是什么呢？我们都知道，TBA120FR的反应杯反应总量为80-360ul，低于80ul将无法通过光路，高于360ul会出现漫盘。所以常规选择一般是选择最大反应总量的70%-80%之间，也就是250ul-290ul之间。例子中是269ul。
很多医院为了节省成本，也很清楚仪器的最低反应量，于是乎把总反应量调整到最低，从而达到节省成本的目的。但往往这么做并不理想，结果很不好。原因有几个方面，仪器给出的最低反应量是在极其理想的情况下得出的，真正使用过程中很难达到这个理想条件，因此在设置最低反应量的时候，要把仪器给出的最低反应量乘以120%-150%，也就是100ul-120ul之间。这一点奥林巴斯比较老实，声称最低反应量为80ul，但要求90ul，由此可见一斑。
还有一点就是如果按照比例配比，样本量会很低。还是按照这个例子，把20:3换成20:1，也就是样本量1ul，R1量改为70ul，R2量改为25ul，反应总量为96ul，超过最低反应量80ul很多，理论上应该能够保证准确。但这个世界上应该的事情往往不应该，1ul的加入量已经是极限了，在自动生化仪里，虽然声称加样步进为0.1ul，但没人采用小数量，都是采用正数量，最小也是2ul。如果是1ul，一旦加样系统有问题，比如定量注射器偏差、针尖污染锈蚀等等，很有可能这1ul就加不准，甚至干脆就没加。
那么只把试剂量降下来，样本量不变是否可行呢？试想一下，正常反应1ul样本的试剂，加入了3倍的样本，样本浓度稍微高一点就会导致反应不完全，速率法直接出现底物耗尽，终点法的曲线会看到速率法的曲线，根本没有终点。得到的结果还是不靠谱。
所以理论回归理论，不能一味的节省成本。成本和结果保证之间要有交叉点的，不能是背离的，那样就毫无意义了。
接着说这个上机参数，这里的参数给出了读点，主读点是20-26，弹性读点是18-24，这是东芝雅培和拜耳特有的，别的机型没有弹性读点。
样本加入量是3ul，重测增量和减量分别是10和5ul，当然要稀释，但上面并没有选择稀释量，所以这个功能就没有作用，也就不自动重测。
定标方法选择的是线性，2点定标，并且给出了两个点的浓度，一个是水点，浓度为0，另一个是标准品，浓度*表示标准品标称的数值。
除上面以外，所有的检查都没有做，只是选择了TBA的单位，umol/L。
这个参数基本上是完整的，可以上机录入使用。
4.4翻看仪器的操作说明，登记项目、试剂及校准品的名称、位置、容量、有效期等信息和参数录入：
每种仪器操作都不相同，所以说明书还是要看的。
一般来说，操作步骤是先注册登记试剂，R1和R2要分别登记注册，包括名称（最好与测试项目重名），试剂位置，容量，报警容量等等相关内容。第二步才是测试参数登记录入，包括测试名称、反应方法及方向、样本和试剂量、反应监测等，而后是正常值范围设置，接下来就是定标液和质控的设置以及定标和质控的反应监测等等。在这里就不出图列举了，每本说明书上都有，站上也有很多资料和帖子介绍。
在参数录入的界面里，需要说几句，大部分是 英文，而且很多都是缩写，有时候会搞错。但有个原则，搞不清楚的地方最好默认，不要尝试修改或输入数据。
日本机型都差不多，大致如下：

添加测试项目界面：


详细的分析参数界面


注意上面的英文提示，都很清楚。在分析方法和监测时间后面有四个框，一点终点法输入第一个框，后面默认为0；速率法和两点终点法填写前两个，注意两点终点法第一个要输入R3或R2之前的一个点。速率法要写R2或R3之后的两个点。
而波长的选择上，副波长在前，主波长在后，更要注意。
试剂的选择要注意，试剂容量之后是稀释量，不稀释默认为0，后面跟着的是注册试剂时的试剂编码，一般跟位置号相同，在后面是有效期天数，一般最大为99。
吸光度界限检查如果不采用的后，最后放到最大±32000，反应方向要选择，不然计算错误甚至报错。前带检查之类的可以放到最大，不检查。
日本的试剂参数有些特殊，因为它支持四试剂使用，R1就是第一试剂，这个都可以理解，但R2不是我们常说的R2，并不在5分钟之后加入，而是在1分半也就是5点之后加入，适合用于短程反应，而R3是我们常说的R2，在16点之后，也就是接近5分钟的时候加入，这是常用的方式。所以在日本参数设置的时候，要把R2设置到R3上。R4是在33点之后，也就是10分钟的时候加入，适用长程反应。
第二个页框是定标参数：


有名称选择，定标方法选择，定标点的数量，量程及加权。量程点一般都是2，加权可以不选择，默认为0，单点校正的时候会有作用。接下来是定标间隔、批号有效期以及定标吸光度检查参数。图上都是默认的，不选择或不检查。
第三个页框是正常范围，可以输入不同年龄段和性别的参考值，目前都用LIS，所以这个地方一般都不设置。


第四个页框是标准品的参数，标准品都在什么位置，浓度值分别是多少。


如果测试项目涉及到特殊的公式计算，就需要在公式界面里添加注册，这样就会得到一个计算项目。当然也有直接在LIS上添加一个计算项目的，在主机上就不用了。


上面是日本的参数录入界面，下面是奥林巴斯的：


奥林巴斯是分散登记，上图这个界面仅仅是参数，样本试剂量，方法，主副波长，方向，读点及现行检查等等，LIH样本检测很少用，ISE只针对装有ISE的机型，范围呢也都用LIS的，不用管。
由于奥林巴斯不支持两种以上的试剂，所以只有R1和R2。但为了进行糖化血红蛋白三试剂的测试，单独设置了一个糖化血红蛋白的测试界面：


定标液需要在单独的液面中设置：


下面是东芝TBA120FR的试剂登记界面：


添加项目界面：




下面是Outline窗口，主要是正常值范围危急值范围之类的


Base窗口，主要参数录入都在这里，方法方向波长读点试剂样本量等等


定标窗口


质控窗口.


后面还有交叉污染和重测规则窗口。
在这里设置定标液和质控浓度之后，还要在相应的界面登记定标液和质控液位置。
下面是登记质控：


下面是登记定标液：


这些界面都在各自的说明书里有详细介绍，所以耐心看手册还是有必要的。
4.5 进行校准和质控，判断校准数据、校准曲线和反应曲线是否符合反应趋势，进而修正参数的部分细节。判断质控是否在控。
参数设置完成之后，要进行定标和质控以及样本测试，进一步判断设置的是否合理正确。像几乎所有机型，定标之后都会打印一个定标报告，当然把原机配套的针式打印机拆除或者没有纸张，那就打不出来了，而且贝克曼的定标报告很详细也很复杂。而有些机型不打印定标报告，只是告知定标是否通过，有什么错误提示而已。这里只举例日本的定标报告。


这是正常的校准报告，都是两点线性定标，第一点都为水点。
报告的格式是：
TEST — S1 — S2 — S3 —S4 —S5 —S6 （标准液S1-S6）
上图都是只用了两个定标液，所以只有S1和S2有数据。
每个定标液下面都有左右两列上下两行。左边的列表示主副波长的差，右边的列表示主波长的吸光度值，上下两行表示两次定标结果比对。
理论上讲，两次结果应该完全一致或接近，也就是重复性要好。主副波长的差也就是左列应该越小越好，不同试剂和方法有不同的要求。
如果出现定标失败，会在定标报告上提示，如下图：


第一组TBA的定标，左列值小，重复性也很好，仅仅是因为与上次定标相差了20%而提示，没有关系，重测一次就行了。
而第二组GLU，水点左列和右列相差无几，主副波长的差这么大，试剂和水肯定有问题。而标准点也就是S2点，重复性都没有，而且主副波长差竟然比水点还小，只能认为是放反了定标液，或者定标液就没放，因为有样本提示。
下图是昨天才在群里提问的：


IgG项目，5点定标，可以看出所有点的主副波长差几乎跟主波长吸光度一样，况且日本的机型吸光度范围只有±32000，而S4和S5两点已经接近或超过32000了，校准品和试剂问题很大。后来也承认，定标液过期很久了。
除了看定标报告，还要注意定标提示借此分析定标失败的原因。大多数情况下要看定标曲线。定标曲线又称工作曲线。

这是日本的定标曲线查看界面

下面是日本的定标曲线举例：



下图是奥林巴斯的定标曲线。


下面是东芝TBA120FR的定标曲线界面：


在封闭试剂的机器中，很多并不给出定标曲线，也就是说无法查看定标曲线，例如贝克曼的自有机型。
从定标曲线可以看出，单点或两点线性定标，接近45度的为最佳，而多点定标，根据选择定标方式，越接近曲线趋势的越好。比如日本图例的两张图中，上图是Log4P，很符合，而下图的Mb选择是样条Spline，咋看起来与Log4P的差别不大，但注意第二点的拐点，如果用Log4P就会不符，所以选择Spline样条是正确的。这也就是为什么要验证或修正的原因。
质控测试的目的主要是看是否在控，如果在控可以进行下一步的样本测试，如果失控就要查找原因，及时处理或修改参数。质控测试要查看反应曲线，看看反应曲线是否正确。
下图是日本的反应曲线查看界面：


下面是奥林巴斯的反应曲线界面：


下面是东芝TBA120FR的反应曲线界面：


4.6样本测试，进行重复性验证和线性验证：样本测试主要检查反应曲线是否遵循相应的反应规律，曲线是否平滑，有无跳点，线性如何。重复性验证则是通过机器自带的重复性检测功能来验证机器的可靠性。重复性很好的机器，可以通过定标等手段保证结果的准确，但是重复性都保证不了，怎么定标都没用的。
线性验证主要是检查试剂在一定的区间内的准确程度，高值、极高值、低值、极低值都能否作准。一般采用极高值标本进行倍比稀释分别测定，测定的结果与计算结果进行比对，依次来验证测试方法、定标方法和试剂性能。
4.7 没有上机参数的上机经验：
很多操作人员只有试剂说明书，并没有上机参数，如何输入参数调试成为难点。其实只要明白原理就不难解决。
前面说过，根据试剂说明书的测试方法，反应方向以及样本和试剂的配比，结合生化仪的操作手册，就可以设置参数了。
而读点可能会是一个瓶颈，很多厂家的说明书并不给出读点时间。这个在后面会有说明。
根据生化仪操作说明，得知反应杯的最大和最小反应量，根据前面所讲过的配比方法进行计算后，可以确定样本量和试剂量。
读点是指反应杯通过光度计的时间间隔，或者说反应盘旋转一圈的时间。说明书都会给出下面的图：


这是日本的，从这张图中可以看出日本的机型支持四种试剂，R1-R4。S+R1方式，而且S+R1同圈加入。R2的加入不到两分钟，R3为5分钟加入，一般十分钟反应最后读点为33、34，长程反应到15分钟的49、50点。
由于试剂加入时间是死的，无法改变，那么其在哪一时间加入试剂变得不那么重要。大多数试剂说明书要求R1加入后孵育5分钟加入R2，那么上图也给出了R3是5分钟加入，那就把R2设置到R3上就行了。
那么日本读点间隔到底是多少呢？说明书给出的是18秒。上图给出的R3是5分钟，读点是17点，300秒除以17点，差不多就是18秒。有了这个参数，在设置读点时就有了办法，两点终点法第一点在R3之前，也就是15-16点，第二点在最后一点，也就是10分钟的33-34点上。
注意日本的读点不是一个点，虽然选择的是一个点，但计算的时候是你选择的点和前一个点的吸光度平均值，所以我会写出两个数值，最大的那个数值是输入时的数值。而速率法一定两个点都选择在R3之后，也就是17-34的任意两点。当然要有一定的间隔，不能过近。而且也不能太接近R3的17点。不过这个不重要，随便设一个，比如22-28，设完之后做测试，观察反应曲线，必要的时候修改参数到反应曲线斜线的最佳线段处即可。


这是奥林巴斯的，简单明了。这张图可以看出奥林巴斯只支持2个试剂，也就是R1和R2，而且是R1+S方式。R2的加入时间是P11，也就是12点，而反应时间只有3分27秒，那么一个读点就是差不多18秒。R2之后的反应是5分6秒，总反应时间只有8分33秒，没有长程短程之说。
那么有人就说了，我的试剂说明书上要求R1孵育要5分钟，它只有3分半怎么办？没办法，人家就这么设计的，就3分半吧。不过有些反应曲线R1加入后没有稳定趋势，这就说明R1 的量少了，应该适当增加。很多人设置参数照搬日本或东芝的到奥林巴斯上，其实要考虑R1的孵育时间短的问题。比如下图：






这是东芝雅培的，也是双试剂，9.6分钟33个点，每个点也就是18秒，16点之后加入R2，R1孵育时间是5.1分，R2反应时间只有4.8分，大差不差，跟日本类似。
读点选择之后，将所有的检查都放到最大，也就是不检查，那么基本参数就设定完毕了。接下来设置定标和质控。
定标前面都讲过该用什么方法，定标注册，位置指定，浓度指定等等。质控就设置一个浓度和位置，很简单。
有人说了，我既没有日本东芝奥林巴斯的图，也不知道机器的读点间隔，更不知道R2什么时候加入，怎么办？不要紧，也有办法，麻烦点儿就是。
遇到这种情况，直接在参数界面输入方法，主副波长，反应方向，试剂样本配比，这些都在试剂说明书上，不要告诉我没有试剂说明书，你这试剂捡来的不成？
测定方法都不确定的话，先选择终点法，而且是一点终点法。至于定标就选择一点定标或因数定标，设定完成后直接进行定标和样本测试，无需经过质控过程。无论定标是否通过，都能看到定标的反应曲线（不是定标曲线）或者样本的反应曲线，根据反应曲线判读分析，确定到底采用何种方法，读点应该如何选择。
还是用最前面的那个设置错误的例子来


从这个图上看出是R1+S方式，R1在0点加入，S在10点之后，大概是11点加入，R2在15点之后，大概在16点加入。整个反应曲线是终点法的特性，所以在选择两点终点法的时候，第一点应该是15点，第二点应该是30点之后的一个点。按照此思路修改参数，再次测试，看看第一点是否在R2虚线之前，如果是就修改正确了，如果不是，还是在R2虚线之后，那么就在往前移两个点，但绝对不要靠近S加入的虚线。
这是一个大概的思路。如果曲线是速率法的特性，那就选择速率法，取点为斜线线性段最好的那一部分。
从上面的举例中我们看出，读点间隔并不是十分重要，特别是只有两个试剂的机器里，无论R1的孵育时间长短，都无法控制，是设定死的。根据曲线设定读点，必要的时候增加R1或R2量是必须要考虑的。
下面是质控方面的介绍。

5、质控：质量控制在各个生化仪上都有，而且外接LIS上也有质控图程序，将传送过来的质控数据描点行程质控图。在LIS上的质控比较单一，仅仅是做一个质控图。
x-R质控图是最基本的质控图，也是最常用的，LIS上也基本上提供这一种，如下图：


x-R质控图多用来分析日间质控，要通过多规则质控分析法则multi-rule quality control进行分析判断，从而指导维护维修和调整工作。

而二维质控twin plot control多用来分析日内质控，对系统误差和偶然误差更容易分级，下面简单介绍一个二维质控。

日本把二维质控称作实时质控，东芝也称为实时质控：

二维质控是采用两个不同靶值的质控品，在检测过程进行质控跟进。我见过用此法的医院，每50个标本跟进两个不同靶值的质控品，一天大约300多样本，这样就会出来6组12个质控数据，形成二维质控图。12个点都应在±2SD的区间内，否则就要进行判断。

如果存在同一方向的偏差，则可以断定是系统误差，重新定标校准就很有必要了。如果低值偏高或高值偏低，或者整体偏高偏低，那么试剂因素就要考虑了。

虽然二维质控或者叫双质控图比较直观，但应用较少，相应的理论教学也少，所以现在大多数医院还是采用x-R质控图结合多规则质控分析法则进行判断。日内质控很少有人去注意和使用，大多数医院都是早晨开机做一次质控就完了，中间不再进行质控跟进，直到第二天质控失控才会采取措施。

下图就是多规则质控的判断法则：

多规则质控能快速发现实时错误，产生错误时，报警提示违背了哪条规则。需要正常和异常的质控品。

12s 根据质控限制判断是否超过±2SD

13S：判断是否超过±3SD，如果没有，进行22S的判断。

22S：判断是否在同一方向上超过±2SD，如果没有，进行R4S的判断。

R4S：判断两个连续数据在同一范围内超过4SD，如果不是，进行41S判断。

41S：判断是否有4个数据超过±1SD，如果没有，进行10X的判断。

10X：判断连续7-10个质控是否都在一边偏差，如果没有，则认定在控。

质控限制  错误符号   错误原因

超过13S      2        随机误差

超过22S      3        系统误差

超过R4S      4        随机误差

超过41S      5        系统误差

超过10X      6       系统误差

Random errors（随机误差）

分配不精确（样本，试剂）注射器泄露，空气引入管路系统，探针脏，试剂排出位置偏斜等。

比色不精确、灯坏。

试剂变质

质控标本不良，取错标本，不同批号等。

清洗不足，搅拌棒清洗不良或不足。

混合不良，检查阀，比色杯支架检

测，搅拌棒的探测装置。

Systematic errors（系统误差）

定标不正确，不恰当溶解标准液。

试剂变质，不同批号等。

温度，不恰当的温度控制。

在x-R质控图上，可以运用多规则质控，分析一段时间内的质控状态。

上图清楚的显示出随机误差和系统误差的判断。出现系统误差，就要考虑更换试剂，重新定标。出现随机误差，就要维修工程师出马，维护保养甚至维修设备。所以机器不是说不能动了再需要工程师的。

6、结果与曲线的判读：

在这里https://www.yeec.com/forum.php?mod=viewthread&tid=39885是以前写的拜耳官方的曲线解析。大家有机会好好阅读一下，很有帮助。

其中有两张典型的曲线，一个是下图：

官方给出的解释是试剂泡沫引起的。除了试剂瓶口的泡沫造成的这种现象外，R针或搅拌针半堵或者太脏，也会造成试剂或混匀时出现泡沫。所以在维修时要注意，这种图又被形象的成为心电图。

下图官方的解释是低于最低反应量：

光束根本没有照射到样本。如果参数没错的话，试剂针不是堵死了，就是与反应杯位置偏差太大，不知道加到哪里去了。当然注射器或管道泄漏也有可能，试剂没加上或者干脆漏到途中了。

上面两张图还可能是反应杯壁有气泡（水浴机型）甚至孵育槽的液体有气泡或者反应杯外壁有水珠（空气浴机型）。

反应曲线应该平滑，如果出现非常理出现的拐点、跳点则应该考虑系统故障。当然，不同的机器或试剂稍有不同，有些机器或试剂在R1或R2加入的时候本身就有应激拐点，这就属于正常的了。

比如拜耳的机器：

这张图就是正常的。

小东版主的几篇帖子很有代表性，下面复述一下：

一张是底物耗尽的曲线，吸光度值超过40000

还有一篇是D二聚体的六个定标曲线，分析读点的准确性：

原文如下：

通过六个不同浓度的定标反应曲线可观察到随着浓度的增加测定曲线逐渐不成线性，最后一个浓度最能体现这一点，图中可见21点以前线性很好，其后出现拐点。所以此测定两点速率法测光点以17点和21点为最佳。

跳点往往预示着交叉污染，而交叉污染又会导致结果没有重复性。交叉污染的检查方法都与反应杯接触的部件有关：样本针、试剂针、搅拌针和冲洗针，任何一个针壁污染都会导致。当然样本针、试剂针、搅拌针在各自的冲洗站里清洗位置和水量也要足够，除此之外，这四组针还不能出现滴漏情况，否则一样结果乱套。所以，出现所谓的交叉污染，不要先想着更换试剂通道，调整什么交叉污染项目。现在的生化分析仪，特别是进口机器，根本不存在真正意义上的交叉污染，而是上述的部件出现了问题，需要维护保养甚至维修解决。

下图是针污染的典型图片，任何机型都有此类现象，大多与选用的试剂、清洗剂和维护保养周期及手法有关。

下面是跳点的典型图例：

下图是一张典型的终点法高浓度标本没有反应完全的图例，就是俗称的终点法中见到了速率法的曲线：

下图是典型的多瓶定标液定标的结果，为了增大检测范围，定标液的定值被不符合规则的任意提高：红圈标准的两个点的值根本不符合倍比关系。

由此做出来的定标曲线自然也不符合样条趋势，勉强算对数曲线，所以期间的有些结果会大相径庭。

下图是胡工的帖子，是试剂管路中有试剂结晶，偶发性的滴落到反应杯中，促使反应无法稳定而持续不断的进行。

下图也是一个典型的用多瓶定标液定标，定标值不按照倍比关系，导致结果混乱的例子：

下图是定标液是倍比的，但做出来的曲线不对，原因是吸光度值变化很小：

可以看出第一点和最后一点的吸光度只有363的差异，这怎么可能。曲线做出来弧线，根本不是样条趋势。而下面的反应曲线更是热闹：

第一张图升反应成了降反应，第二张图R2加入没有显著变化，所有现象指向一个地方，就是试剂放错了。

下图是一个一味降低反应量的例子：

总反应体积只有130ul。

定标后的定标曲线竟然是这样的：

而反应曲线如下：

前一张是负值，后一张是正值，但可以发现，二者的下降斜线都不明显，之所以出值仅仅是因为定标的原因。定标曲线严重倾斜靠近X轴，那就意味着稍微有点儿吸光度的变化就会导致浓度值的大量变化。而出现负值的曲线里，R1之后竟然是副波长喧宾夺主，可见试剂空白怕是过高，所以参数和试剂都不靠谱。

下图也是一张反应杯外壁有水珠的曲线例子：

下图是线性出现问题，意味着试剂加入和搅拌出现问题：

上面三张图的起始吸光度都超过了奥林巴斯的3.0的最高范围，首先要排除试剂问题。

7、旗标和错误的判读及分析：

无论是定标、质控还是标本测试，结果背离预先设定的检查范围时，设备都会在结果上出现提示，告诉用户结果不准确、定标失败、失控等等，在结果上出现的提示叫做旗标。

不同厂家的旗标含义不同，一般是电脑键盘上的单字符，各家的含义在操作手册上都有明确解释。之所以采用旗标，是在结果列表中，没有足够的空间用文字表述。旗标中有的是严重警告，出现这种情况将没有结果出现；还有的是一般性警告，出现的结果严重值得怀疑；还有的仅仅是提示，不影响结果的可靠性。而这些旗标显示的时候是单个字符，直接打印的时候是缩写，传到LIS上的时候也是单个字符。

下面是日本机型的数据错误旗标：

比如日本的机型中结果出现旗标A，打印提示是ADC？，这就是严重警告，数字转换都出现问题了，自然没有结果。而旗标F，打印提示是LIN.，则表示一般性警告，线性出现问题，结果不可信，需要查看参数设置和曲线进行进一步的判断。出现旗标*号，则是一般性提示，告诉操作人员这个结果被人工编辑过，至于为什么编辑，操作人员肯定知道。

下面是奥林巴斯的数据错误旗标

异常数据标志
标志	定义	处理
（	清洗剂不足，造成消除污染失败。	添加清洗剂.
R	试剂水平探测器认为试剂量不足，相关的分析项目被停止。	添加新试剂，重复分析产生该标志的样本。如果检测一直异常，试剂瓶内可能有气泡，消除气泡，擦去瓶口的水分，如果在试剂探针有污物，擦去。如果检测一直异常，更换试剂探针。
#	样本水平探测器认为样本量不足，停止加样。	添加样本，然后重新测定。如果检查异常，不考虑样本量，清洗样本探针。如果检测一直异常，更换样本探针。
%	样本探针被样本阻塞。	清洗样本探针。如果一直发生这种情况，更换样本探针。
?	异常光电测定值.因为光电数据无效，不能计算数值.停机和(或〉光源灯烧坏.标志被显示在数据表中。	如果出现其他标志，附加"?"，按标志推荐操作.如果没有其他错误标志，检查光源灯和相应的比也杯之后重新分析.如果系统一直不能从错误中恢复，与奥林巴斯服务部联系。
U	试剂空白分析时，该分析项目光电测定最后一点的OD值低于设定的参数低限值.如果校准时产生异常数值标志(包括试剂空白分析)，校准数值将不能被自动更新.	检查参数，然后检查试剂是否变质和装载在正确的位置.如果试剂已经变质，更换试剂.如果试剂放铺位置，纠正错误.
U	试剂空白分析和〈或〉常规试剂分析时P0点的试剂OD低于设定的参数低限值.	同上。
&	前带判断发现异常	稀释样本，然后重新分析.
Y	试剂空白分析时，该分析项目最后一个测定点的OD值大于设定的参数高限值.	检查参数，然后检查试剂是否变质和装载在正确的位置.如果试剂已经变质，更换试剂.如果试剂放铺位置，纠正错误.
y	试剂空白分析和(或〉常规试剂分析时P0点的试剂OD大于设定的参数高限值.	同上.
$	当采用连续监测法测定，产生"D"和 "B"时，因为少于 3个有效测定点，反应的线性不能被测定. "	稀释样本，然后重新分析.
@	异常高值.反应OD值超过 2.5(在双波长测定中，如果双波长之一的OD超过 2.5发生该错误)	稀释样本，然后重复分析。如果检测波长不同，校正.如果样本指出异常高值，稀释样本.如果样本是高乳糜样本，进行高速离心，然后稀释样本.
B	负-斜率连续监测法测定中，反应太快。在连续监测法测定中测定吸光度下降时， OD值高于设置的 Min. OD（最小光密度)的读点数值小于 2。这种情况下，不显示测定数值。	检查参数，稀释样本，重新测定。
D	正-斜率连续监测法测定中，反应太快。正-斜率两点测定中，起始点或结束点的 OD值超过吸光度参数设定的上限。在连续监测法测定中测定管吸光度增加或下降时， OD值低于设定的 Ma x. OD（最大光密度)的读点数值小于 2。这种情况下，不显示测定数值。	检查参数，稀释样本，重新测定。如果样本是高度溶血标本，重新留取标本，重新测定。如果样本是高乳糜标本，如果可能，高速离心标本。
*	在连续监测法测定中，样本反应不成线性.测定值变化超过己设定的线性参数界限。	检查参数，重新测定。如果样本指示异常高值，稀释样本，重新测定。异常经常发生，联系奥林巴斯维修部。
！	不能计算数值。例如：吸光度大于标准曲线界限。因为浓度不能转换，显示测定的OD值。	如果没有发生其它的错误，将样本稀释后重测。如果经常发生，联系奥林巴斯维修部。
F	测定值超过参数设定的动力学范围上限。在多点标准曲线中，数值超过最后一点 Abs。	稀释样本，然后重新测定。
G	测定数值超过已经设定的参数动力学范围下限。	重复分析.由于在吸光度0附近发生测定错误，才发生该错误。这不是因为系统故障。
p	数值符合参数内指定的风险值。	数值一般在动力学范围内。通过重复测定检查数据。
P	指定检查项目的定量结果：阳性.	没有特殊操作要求。
N	指定检查项目的定量结果：阴性.	没有特殊操作要求。
T	在项目之间检查时检出异常.这也许是已经被检出项目的异常数值。	重复分析。如果结果和以前相同，也许不是异常。数据为病理异常.
H	测定结果超过参数设定的参考范围上限。	结合临床资料判断结果。
L	测定结果超过参数设定的参考范围下限.	结合临床资料判断结果.
J	测定结果超过参数设定的重测范围的上限.	产生的标志为了输出结果，但不用于保存质控数据。
K	测定结果低于参数设定的重测范围的下限.	同上.
a	试剂过期	更换试剂，执行试剂稳定期复位。
x	采用多规则质控时，如果一个质控中的测定值超过质控范围（如2-6错误），则另一个质控测定值被标识为x。	标志的数据不被统计，因为不是异常数据，没有特殊操作要求。
1	单一质控数值超过质控范围。	失控。
2	双质控数值超过2SD范围。	系统误差。
3	双质控数值超过3SD范围。	失控。
4	双质控数值连续超过R4S范围。	随机误差。
5	双质控数值连续4次超过1SD范围。	系统误差。
6	多规则质控数值连续10次大于或小于均值。	系统误差。
7	双质控数值趋势编程上升或者下降。	系统误差。
S	重测数据被更新。	无特殊操作。
/	未测定项目，虽然选择了该项目，但没有测试。	重新选中该项目，重测。
r	结果已经上传到LIS。
e	结果已经被编辑过。
c	结果已经被校正过。

东芝的机型也是如此：

数据错误列表
优先级别	错误码	错误信息	系统动作	操作员动作
2	WTR	去离子水容量不足	样本操作停止	检查去离子水箱是否灌满，如不能找到原因，联系工程师
1	ss	样本体积不足	跳过该样本的检测	添加足够的样本重新检测
1	RS	试剂量不足	与试剂有关的项目测试跳过，	添加足够的试剂重新检测
3	cos	样本针清除携带污染用清洗剂不足	测量继续	添加足够的清洗剂重新测试
3	COR	试剂清除携带污染用清洗剂不足	测量继续	添加足够的清洗剂重新测试
4	BWI	水槽水位低或温度异常	测量继续	如果反复发生，联系工程师
2	HRD	硬件错误		如果反复发生，联系工程师
2	LMP	光亮度不足	测试停止	更换灯泡
1	OPT	吸光度数据获取失败	测试停止	如果反复发生，联系工程师
2	ABS	杯空白吸光度校正数据计算错误(0.1到3.0 Abs).		检查杯监测，如果高活性或高浓度样本存在，稀释样本或减少样本体积重新测量。
6	A#0	没有数据点出现在指定的曲线读点范围		检查反应监测.如果高活性或高浓度的样本，减少样本量或稀释样本重做。
6	A#1	只有一个数据点出现在指定的曲线读点范围		检查反应监测.如果高活性或高浓度的样本，减少样本量或稀释样本重做。
11	A#2	只有两个数据点出现在指定的曲线读点范围		检查反应监测.检查这两点数据是否在参数设定的范围内，如果不在，重新计算并设置参数。
8	NOS	终点法测试时读点数据超过指定的范围		检查参数设定是否适当，也有可能是搅拌不充分，灯泡问题，反应液气泡，试剂问题等，找到原因纠正后重测。
8	LIN	速率法测试时吸光度线性超过指定的曲线设置范围		检查反应监测，如果样本活性太高，减少样本或稀释样本重测
5	RAC	前带检查值超过指定范围	（抗原过剩--前带现象）	检查反应监测，如果样本是前带样本，减少样本或稀释样本重测
8	CAL	定标曲线检测出定标失败		重新生成定标曲线
8	BLK	试剂空白超过检查值范围		试剂变质，更换后重新生成定标曲线

8	MUL	多点定标变化超过指定范围		试剂变质，更换后重新生成定标曲线
8	SPN	定标曲线斜率检查错误，定标曲线斜率控制值的标准样本值和试剂空白之间的差异		试剂变质，更换后重新生成定标曲线
8	FAC	因数值背离先前指定的FAC Error Limit		试剂变质或定标设置错误，处理后重新生成定标曲线
8	SD	定标曲线非线性，检查值的测量值和近似值差异太大		重新生成定标曲线
8	CRV	定标曲线没有变化		定标液位置不正确，正确放置定标液重新生成定标曲线
8	CON	非线性定标曲线系数计算颠倒		重新生成定标曲线
9	TIM	定标间隔过期或试剂过期		如果需要，重新生成定标曲线
2	CNF	定标曲线计算结果超过外推计算范围		如果需要，减少样本量或稀释样本重新测试
10	PVU	低浓度活性的值低于参数指定的危机值		若有必要，增加样本量重新测试
10	PVO	高浓度活性的值高于参数指定的危机值		若有必要，减少样本量或稀释后重做
12	FLX	采用弹性读点		结果认可
7	CON	重复进行指定样本的测试，计算值与近似值差别太大		重新设定样本量，重新测试
13	PRM	参数设置不正确		复查参数设置重新测试
1	MIS	由于参数错误不能进行计算，如定标错误等		复查参数设置重新测试
14	ETC	其他未加以分类的错误
9	LRU	预先校正结果低于浓度范围下限		增加样本量重新测试
9	LRO	预先校正结果高于浓度范围上限		减少样本量重新测试
1	CLT	样本针检测到样本凝结	跳过该样本继续下一个样本	检查样本及样本针，处理后重新测试
15	RC	使用试剂测量结果与同一个标准品有差异（不同的试剂批号和试剂瓶）		定标曲线太大，若有必要，重新计算

ISE有关错误信息
优先级别	错误码	错误信息	仪器动作	操作员动作
2	WTR	去离子水容量不足	停止测试	检查水箱等
1	SS	样本容量不足	跳过此样本，继续下一个	添加足够的样本重新测试
1	RS	试剂量不足	相关的测试被跳过	添加足够的试剂重新测试
3	COS	样本针携带污染清洗剂不足	相关的测试被跳过	添加足够的清洗剂重新测试
3	COR	试剂针携带污染清洗剂不足	相关的测试被跳过	添加足够的清洗剂重新测试
4	BWI	水槽水位低或温度异常	继续测试	如果反复出现，联络工程师
2	HRD	硬件错误		如果反复出现，联络工程师
2	M.E	Ion caliper容量不足	相关的测试被跳过	添加足够的Ion caliper重新测试
1	BIA	电极电势超过可测量的范围	相关的测试被跳过	检查Ion caliper容量和更换旧的电极，重新测试
5	MDR	样本测量之前和之后的Ion caliper电势差异超过指定范围	测量继续	检查数据的设置，有必要重新测试
6	MST	Ion caliper电势超过指定范围	测量继续	Ion caliper或ISE电极老化变质
7	CAL	使用不恰当的定标曲线计算	定标曲线重新测算	重新测算后，重做样本
7	SPN	定标高区差异超过斜率范围		Ion caliper, ISE 缓冲液, calibrators L/H变质, ISE电极可能存在问题，找到原因处理后重测
7	ISE	定标曲线斜率低于45%		Ion caliper, ISE 缓冲液, calibrators L/H变质, ISE电极可能存在问题，找到原因处理后重测
7	COT	补偿值超过指定范围		补偿值调整错误
8	TIM	定标曲线间隔过期或试剂过期		重新定标后，重新测试
10	APO	上一样本浓度低于危机值	测试继续	检查数据，有必要，重新测试
9	PVU	浓度低于参数设置的危机值		检查数据，有必要，重新测试
9	PVO	浓度高于参数设置的危机值		检查数据，有必要，重新测试
11	PRM	参数设置不正确		重新设置参数，重新测试
1	MIS	由于参数设置错误计算无法执行		重新设置参数，重新测试
12	ETC	其他未分类的错误
8	LRU	修正之前的计算结果低于浓度下限范围		检查数据，有必要，重新测试
8	LRO	修正之前的计算结果高于浓度上限范围		检查数据，有必要，重新测试
1	CLT	样本针检测到样本凝结	该样本跳过	检查该样本，必要时重测，同时检查样本针

与定标有关的错误
优先级别	错误码	错误信息	仪器动作	操作员动作
1	FLG	成分错误		检查必要的成分含量测试
3	PVU	低浓度低于危机值范围		检查必要的成分含量测试
3	PVO	高浓度高于危机值范围		检查必要的成分含量测试
4	PRM	参数设置错误		重新设置参数
1	MIS	由于参数设置错误，计算无法执行		重新设置参数
5	ETC	其他未分类的错误
2	LRU	修正之前的计算结果低于浓度下限范围		检查数据，有必要，重新测试
2	LRO	修正之前的计算结果高于浓度上限范围		检查数据，有必要，重新测试

可以看出东芝的旗标几乎都是三个字符表示，当结果中有FLX提示的时候，结果是可信的，只是告诉操作人员这个结果是采用了弹性速率读点得出的，也就意味着这个标本造成了底物耗尽。可以查看曲线进一步的进行判读。

拜耳的机型旗标比较少，如下图：

旗标越少，每个旗标所代表的含义就越多，问题指向也就越宽泛。但也有好处，那就是减轻记忆压力。

与数据错误旗标不同的是，故障错误就显得详细很多，不仅有错误代码，还有错误的详细解释，甚至有的错误还有字码，将故障指向更为精确的一个部件组件，甚至指向一个具体的零件。而且故障错误是分级的，不同的故障级别仪器有不同的对应，最高级是紧急停机，所有再测项目中断，这是很严重的错误了；还有的仅仅加样停止，已经加样的测试继续完成；还有的仅仅是警告，提示你某种试剂或者耗材没有了，与这种试剂或耗材有关的项目不做而已。

每种机型的故障报警解释操作手册和维修手册上都有介绍，只不过操作手册上往往只是一句话，而且不是那么完整。而维修手册相当的完整，并且维修手册上还有大致的处置方法和对子码的分析指向。

所以在简单的错误出现时，操作手册就有了指导意义，而带有歧义的错误就要依靠维修手册进行分析判断了。

使用维修手册的故障错误分析进行判断故障的具体成因，需要对设备的结构、管路、电路及工作时序有着一定的认识和了解，否则一样会云山雾罩。

在日本的故障代码中，首先看到的是由横线分割的两组数字，甚至是三组数字，第一组是主码，后面的是子码，然后是报警名称；接下来是报警级别，一般分别WARNING警告、STOP停机、S.STOP加样停止、E.STOP由电源错误引发的停机。

电脑屏幕上错误显示到此为止，而在操作手册和维修手册上会有针对这个错误代码的详细解析、大致的故障判断思路和处理方法。

下图是7600多模块设备的一个报警信息界面：

下图是7180维修手册的故障代码解释：

奥林巴斯机型的故障报警级别用数字表示，1、2、3……，只有报警级别、错误代码、错误信息。但它的错误信息很详细，甚至后面还有错误子码，所以在判断故障原因的时候，仅仅有错误代码是不够的，后面错误信息的全部内容和子码更为关键。

下图是奥林巴斯的错误截图：

报警级别为1的是提示，为3的就是停机了。而报警信息里的红圈则是子码。

在奥林巴斯的操作手册中很简单，并没有全部代码的解释，而且只针对报警信息的英文进行分析，并没有错误代码的查询，所以很多操作人员和应用人员很少看操作手册，很难找到。

而维修手册就详细很多，有报警列表和详细分析两章。

下图是维修手册报警列表截图：

这里可以看到有错误代码Alarm No.，错误内容Message，还有详细信息Information。在详细信息里，还有很多内容，这些就是子码。

据上图举例：3117错误时灯泡关闭错误，也就是暗电流检查出现问题，一般怀疑控制电路有问题。3118是灯泡能量低，一般怀疑漫盘，空气浴的光路上有水珠造成折射而导致的光能量偏低，也可能是光路太脏，更有可能是灯泡老化或电路问题。

再举一个带有子码的例子3124 样本注射器（SA-S）错误，下图是维修手册的详解：

这是注射器上下运动时出错。而前面括号里的数字则直接指明方向：

如果是（1），那就表示样本注射器马达忙。这种情况出现预示着电路或线路出现问题，特别是在等待一段时间或关机重启之后没有改善的情况下。

如果是（2）那就表示注射器的上位传感器SAS01应该是OFF的时候检测到了ON，而（3）刚好相反。（4）表示注射器下位传感器应该是ON的时候检测到了OFF，（5）与（4）正好相反。上面四种情况都预示着传感器有阻挡、太脏、或者干脆损坏。

（6）表示注射器分配之前，样本针的摆动马达忙，这与（1）的情况类似。

（7）表示注射器分配之前，针没有到达停止位，这其实是指无论注射器处于下降还是上升的过程，针都要到达一个停止位置，比如应该在反应杯处分配，在样本盘处吸样等等，但实际情况是机器没有探测到任何一个位置传感器动作，针在一个不明确的位置上。

以上两种情况，都与注射器马达及传感器和电路无关，而要去找摆动马达传感器和电路。

（8）是指在注射器分配之前，样本针上位或中位传感器检测到了ON信号，应该都是OFF。这也与注射器电路无关，要检查上下移动马达、传感器或电路。

后面方括号里的四组数字，是与时序有关，除非很了解时序，否则会看晕。

这是奥林巴斯的时序图，我只截取了与这个错误有关的部分。

方括号里的第一组数字应该0-4这五个数字中的一个，表示处于时序中的哪个时间段出错的。

第二组数字是列表性质，第三组数字是列表号，第四组数字是相序号。由于上图的时序是AU640的，而这个错误代码是AU680的，而AU680并没有给出时序图，所以无法找到对应的关系。不过搞过软件人都清楚，这种程序一定要采用查表方式，才能实时得知各个运动部件目前处于的位置和状态，这些列表就是指的提前编制的数据查询表。

看不懂方括号中的数据没有关系，只要前面的子码搞清楚了就行。前面说过一个例子，就是液面探测并不是随时开启的，而是在需要的时候打开，这与样本杯或试剂瓶容量信息有关。上图Level detection就是液面探测的时序，只有在1之后，3之前的某个时间段里才探测。

而东芝的机型也是类似，因为早有帖子描述，所以这里就不再啰嗦，请看帖子：https://www.yeec.com/forum.php?mod=viewthread&tid=35550

这篇帖子里从定标到报错，到提示都有解释分析，建议好好看看。

所有出现旗标或者错误不要紧张，要完整的保留旗标和错误信息的全部内容，包括主码子码和详细信息。根据这些数据进行查找分析判断，才能更好的准确的找到故障原因。因此，在操作人员求助的时候，要他们提供上述完整的信息很有必要。英文不好，字数太长没有关系，拍个完整照片可以说明一切。

以上就是生化应用方面的一些基本知识，如有遗漏，请跟帖指出。

老大辛苦了，支持老大！~

好东西， 写的真详细，资料挺全的， 新手看看很不错。

老大厉害，好好学习下。

果断很好的东西啊

全面详细，认真学习好，可以解决大部分问题了。版主太有才！

郑老师厉害，谢谢指导！

这个必须点32个赞！辛苦了，非常感谢！

副波长吸光度值超过主波长吸光度值是什么原因？是副波长选择不合理吗？多谢！

有用，学习了。

老大总结概括的很详实，我感觉这些基本上概括总结了我两年半学的生化知识，通俗易懂实用，我学了两年半最后也没悟的这么详实。谢谢老大，老大辛苦了，向你致敬。

浏览一遍都觉得累，更别说整理写作排版了，老郑是楷模啊！

谢谢了，整理得很系统，是新手很好的学习资料

太伟大了，值得深入学习

太全面了，通俗易懂，好好吸收

你帖子说的两点终点法第一点必须是要在加R2之前读取吗？那有一些免疫试剂为什么要在加R2之后延长一两个点读取呢？.