再谈两点终点法的读点

3月份发了一篇生化应用方面的一些知识，目的是阐述一些基本的生化应用方面的知识。但帖子发出后，不少人指出其中描述的两点终点法读点在R2之前之后各一点的说法有误，理由是很多项目就是这么设置的（两个读点都在R2之后），还有的理由是试剂特殊，需要延迟读点。而延迟读点的做法就是两点都在R2之后。
我从不争没米之糠，但米是米，糠是糠，绝不能混淆，绝不能指糠为米或者指米为糠，这是原则问题，我争的恰恰是原则。
两点终点法的定义是“取反应尚未开始时读取一个点的吸光度，待反应达终点时再取第二点的吸光度。用第二点吸光度减去第一点吸光度的差值来计算结果。主要用于扣除试剂和样品空白。保证结果的准确性。一般双试剂用。”这个定义毫无异议，很多人容易跟两点法（固定点法）或者叫两点速率法混淆，两点法或者两点速率法才是两个点都在R2之后，因为它是速率法，必须在反应启动后读取两个点进行速率计算。
很多设备的参数设置界面都是英文的，特别是反应方法这个选项几乎都是英文缩写，2-point END和2-point Rate及Fixed point还是很容易区分的，都知道END是终点法。
我翻看了许多厂家的操作手册，关于两点终点法的介绍，以AU680的介绍最为易懂，所以我截图如下，相必大家都看过：

反应吸光度值的公式没有推导完，推导结束后的结果是：反应光密度值 = Px - K3 ⋅ Pz 。
根据上面的定义，我们可以肯定的得出一个结论，两点终点法就是反应启动前后两点，也就是R2前后两点，除非试剂的反应启动不是R2，这里不考虑两种以上试剂的情况。而单试剂几乎不采用两点终点法，这是常规做法。
那么，如果两点终点法的读点都在R2之后会怎么样呢？1、结果偏低，虽然定标质控都过，但高值做不上去，低值做不下来，总体来看结果偏低，有时定标通过，质控偏低。2、多点定标高值点做不上去，定标失败，不得已只得删除最高值点勉强通过。这两点是最常见的。
下面举一个代表性的例子，这是在前几天培训时发到群里的。
用一句话描述提问的问题：东芝TBA120FR的生化仪，新增甲胎蛋白项目，多点定标最高点不通过，删除最高点后第二高点依旧不通过，询问原因。
这类问题自然要发曲线图，下面是几张图：



上面的第一张图，是六点定标的定标曲线界面，六个点浓度依次是：0，23，105,195，378，739。
从这六点的浓度来看，是采用厂家提供的五瓶带有浓度标定的校准液，并不是用一瓶校准液进行梯度倍比稀释制作的定标液。
由于定标方法采用的是spline样条曲线，所以这五瓶浓度由于没有梯度倍比关系，即便定标成功，也不会符合样条特性，这是第一个疑点，可以说是采用了错误的定标液定值。
由于第一张图最高点突然降低，不符合样条特性，所以失败。还有一个重要的问题，就是五个校准点的吸光度值ABS，第一点水点的吸光度值为-0.0034，第二点为0.0226，第三点为0.0681，第三点为0.0848，第四点为0.1080，第五点为0.0882。除掉第五点不提，前四点的吸光度差只有0.1，而浓度差居然高达378，这简直疯狂，任何人都不会相信的。
至于第五点为什么会突然降低，一般的理解都是定标液错了，拿错或者当初标定错误都有可能。由于最近对两点终点法的争论很多，我见得也多，所以没有怀疑拿错，而是怀疑读点错误。
第二张图是应用人员删掉了最高值点，更改样条曲线为log4P曲线，但依旧没有通过。四个点的浓度值没有变化，吸光度值却有些许变化，依次为-0.0079，0.0318，0.0729，0.0948，0.0961。吸光度差和浓度差依旧很小和很大，而且由于曲线不符合对数特性，实测点与拟合曲线背离，自然也不通过。
同时这张图也反映出一个问题，就是两次测试的同点吸光度，误差有些大，说明仪器并不在状态，也就是说重复性不好。这是另外一个层面，暂不考虑。
基于读点错误的考虑或者基于参数错误的考虑，主要是样本或试剂加入量的错误考虑，我要求提供参数界面，进行进一步判断。参数界面如下：



参数界面显示，AFP甲胎蛋白项目，采用END UP，也就是终点法上升反应，S样本值15ul，R1试剂量180ul，R2试剂量45ul，主读点31-32，空白读点21-22。看到这里，我就知道参数读点错了，原因就在空白读点21-22上。
东芝的TBA120FR是800速生化仪，样本针一个，试剂针两个，S+R1+R2方式，样本加入后直接加R1，然后搅拌读第一点，每隔18秒读点一次，16点后加入R2，搅拌后读第17点，总反应读点为33点。
下图就是这个机型的反应读点示意图：


综上所述，参数是输入错误。主读点31-32没错，空白读点应该是15-16。
那么为什么两点终点法的读点都在R2之后，数值会偏低呢？或者吸光度差会很小呢？
用下面的图来解释


上面说了，两点终点发的吸光度计算是第二点减去第一点，上图就是两点终点法的读点都在R2之后的例子，第一点吸光度是0.9134，第二点吸光度是1.0326，吸光度差为0.1291，这也是刚才那个例子的第五浓度点，也就是最高浓度点。
那么刚才那个例子的第四浓度点，也就是第二高值浓度点的图如下：

第一点吸光度0.9775，第二点吸光度1.1189，吸光度差为0.1414。
由于浓度是根据吸光度差计算的，所以第四浓度点的吸光度差大于第五浓度点的吸光度差，浓度值自然第四点大于第五点，所以出现突然的下降造成定标失败。
上面解释了为什么最高浓度点定标不过的情况，这也是绝大多数的情况，应用工程师遇到此类问题都是采用删掉最高浓度点的办法。但是要知道，删掉最高浓度点，定标曲线就不完整甚至根本就不准确，高值结果根本不靠谱。但很少有人计较这个方面，最常见的理由就是反正已经超过正常范围了，再不准确也是阳性的。小心啊，医疗纠纷就是这么出来的，很多新兴的试剂厂家号称为医院承担一切因为试剂引起的医疗纠纷，就这样设置真的承担不起。
回到刚才的第五浓度点的图，如果R2之前之后各一点会怎么样呢？R2之前的吸光度值几乎就是0，R2之后的读点吸光度值为1.0326，差值是1.0326。根据这个差值计算的浓度肯定会吓人一跳的，不过重新定标后就会趋于正常。这样的差值范围，就不会出现低值不低，高值不高的现象。前提是在试剂的线性范围内。
不过第五浓度点的曲线有些波动，疑似仪器不在状态，搅拌出现问题导致的，也许浓度真的很高，试剂能力不足导致。不过这已经不是关键。
下图是我画的一张图，模拟不同浓度的反应。根据化学反应的特点，在试剂量和样本量不变的情况下，浓度越高反应越快，这张图就是依据这个特点画出的。

假设两点终点法的读点都在R2之后，R1和S的空白假设一样，因为都在R2之后了，R2之前的任何变化都不在考虑范围了。
样本的浓度依次是低（黑色）、中（绿色）和高（红色），按照其反应速度大致画出的曲线。如果读点都在R2之后，那么选择P1点为第一点，P2点为第二点，每种样本的两点吸光度差值就是相同颜色粗线和细线之间的值。图中很明显可以看出，浓度越高差值反而越小。从这张图上也可以看出，为什么两点终点法多点定标的高值容易定标不过了。
就在我写这篇帖子的时候，群里又提问，是ADVIA2400的仪器，脂蛋白A LPA定标第一点和第四点不过。
ADVIA的定标曲线有些特殊，第一点无论是不是水点，都是红色，无论第一点是否过原点它都从原点开始描绘曲线。所以第一点为红色不会定标不过，关键是第四点。
由于提问者没有拍摄定标曲线和反应曲线，只提供了参数界面，所以只能分析参数界面：

再看一下ADVIA官方的方法解释：

而ADVIA的设备目前在国内市场上能见到的主要有四个型号，ADVIA1200/1650/1800/2400，除1800和1650一样外，三类机型的读点和R2加入时间都不相同。ADVIA2400十分钟41个读点，R2加入时间是22点之前21点之后。
所以根据上面所讲的，对方采用了EPA终点法，双试剂也就采用两点终点法。正确的读点应该是M-DET.P.M应该是39，M-DET.P.N应该是41。这是主读点，而空白读点应该是S-DET.P.p应该为19，S-DET.P.r应该为21。
以上两个例子说明两点终点法的读点知识。
我相信，即便是我写这个帖子，还会有人说某某项目就是都在R2之后读点的。是的，确实有两个读点都在R2之后的，但那是速率法、固定点法或两点法，并不是两点终点法。固定点法或两点法是速率法的一种非常规方法，不计算线性的情况下采用的方法。一般国内厂家的试剂，常规速率法无法做出符合要求的线性时，会采用这种非常规的速率法来规避线性检查。
如果还有人说确认是两点终点法的读点都在R2之后的项目，那肯定是参数错误，没有别的解释。
上面第一个例子，对方给我一份说明书的照片，也就是AFP的说明书参数：

照片上清楚的写着“混匀，置37℃孵育1分钟，读取吸光度A1，孵育5分钟，读取吸光度A2，计算△A/=A2-A1。”
也正是因为这个说明书，造成对方强调他们的试剂特殊，需要延时读点，所以都设置到R2之后了。
首先，生化反应里面没有什么延时读点的概念，这并非我孤陋寡闻，查遍百度也没有这个概念。
其次，这个说明书语法严重歧义，“△A/”是什么？为什么要在△A后面加/？孵育一分钟读取A1，孵育5分钟读取A2，是1分钟读一个点，再隔5分钟读一个呢？还是总共就5分钟，第一个1分钟读一个，第五个1分钟再读一个呢？
所以，这份说明书的歧义很重，而且我认为是错误的，应该把“孵育1分钟，读取吸光度A1”写在R1之后，R2之前的格子里。
很多人说试剂配方不同造成的，理由是很多乳胶类的试剂，免疫类的试剂都是在R2之后读点的。这都是错误的，前提是采用两点终点法都在R2之后读点。否则，速率法，两点法，固定点法肯定都在R2之后的。
而厂家对此的解释更是莫名其妙，读点都在R2之后，理由之一是可以去掉S+R1+R2的空白。这简直荒唐，R2加入之后都启动反应了，哪里还有什么空白？还有的解释是这样可以增加灵敏度，更是无稽之谈，上面我画的那张图很清晰的表示出，浓度越高吸光度差反而越低，哪里来的增加灵敏度？
还有的同行私下认为厂家设置成R2之后，可能是因为自身的试剂稳定性不好，所以不得已而为之。但实际上，这样设置，恰恰是不稳定的根源。因为医院的操作人员很少看曲线，大多是查看结果，也就是浓度值，只要与病理或者科室或者年龄性别相符，也就不再注意了。但如果你的数值总是偏低，或者高值不高低值不低，就会说你的稳定性差，或者说你的灵敏度差，其实这是个误区。
生化反应方法只有两种，就是终点法和速率法。终点法的变种是一点终点法，两点终点法，血清空白通道法。速率法的变种是速率法，双速率法，两点法（固定点法）。至于日本特有的双项目不在讨论之列。
反应方法与什么试剂什么配方无关，无论是采用什么配方，无论你是进口还是国产，只要采用这些反应方法，就得按照相应的反应方法原则去做，不要找任何理由和不存在的理论去证明你的错误，这与指米为糠或者指糠为米的性质是一样的。
这么多年来，我也无数次遇到这种情况，统计看来几乎都是那些新兴的试剂厂家所为。所以，我奉劝这些厂家，在积极拓展销售为上市圈钱做准备的时候，不要忘了根本。这种原则上的误区、错误，会害了使用医院，误导医生和患者，试想如果患者是你或者你的亲人怎么办？最终倒霉的将是企业本身和广大的投资者，到那时别说圈钱了，坐牢都不稀奇，上升到欺诈的后果对于一个上市公司或者即将上市的公司意味着什么相信都很清楚。
看看书吧，那些都是理论，也是真理。不会因为偶尔几次侥幸就会被改变的。

老大辛苦了，那么晚了还在工作

老大辛苦了，支持老大！~

我们该深思的不光是方法层面,其实做事的态度才是关键.支持老郑！

谢谢！受教了，非常感动，郑老师辛苦

郑老师科学严谨的态度和无私，体现了大师范儿，顶你！

谢谢郑老师！受教了

刚接触这块的时候，纯纯地被厂家忽悠要在R2加入后读点，问题原因都说胶乳试剂都是这样，扣除试剂样本空白。懵懵懂懂的我觉得：哇塞！果然好NB。。
只是越到后来越怀疑这个理由是否站得住脚？如今郑老师一说，算是也要去他们那边跟他们讲讲这个道理跟道德了。。。

不错，受教了

做医疗仪器是良心活啊，坑钱是小，坑人是大啊！

支持纯粹的技术分享！技术力量是强大的！

值得学习

简单深入，写的很好！赞！

谢谢！描述的好详细，要学习大师的渊博和耐心。

郑老师，读完您的文章受益匪浅！谢谢！

郑老师，帮忙看看这个，也是两个读点都在R2之后的终点法项目，校准曲线，质控和样本做得都不错

附带说明书

设错了。厂家给的就错了。结果还不错那是你没有遇到特殊病例，看看反应曲线就知道了。多点定标还没有水点，再说也不是样条曲线。
错误就是错误，无论你怎么争辩都是错的。

Ray@zybio 发表于 2014-8-12 17:39
附带说明书

我要是给你这个说明书你会怎么说？

Ray@zybio 发表于 2014-8-12 17:33
郑老师，帮忙看看这个，也是两个读点都在R2之后的终点法项目，校准曲线，质控和样本做得都不错 ...

再给你看一个厂家的说明书片段，一个项目既可以做速率法也可以做终点法，你看看它给出的读点。
明显的没有动脑子，直接复制过来的。
所以说厂家给的参数不能照搬，说明书错误百出是经常的事情。不要费尽心机找理由为错误的东西找借口。