生化热点问与答

一、遭遇严重脂血的标本时，
在对它进行生化项目检测时该如何处理？
解放军第202医院检验科邱广斌主任：脂血标本是临床检验常见的干扰原因。血脂中的CM和VLDL是悬浮颗粒，对生化检测常用的比色法或比浊法有极大干扰。对于重度脂血样本，由于样本的本底吸光度过高，必须对样本进行预处理。常用的方法包括：
1、生理盐水稀释法：大部分全自动生化分析仪都具有自动稀释、自动换算功能；也可以先手工稀释，再将测定结果乘以稀释倍数。
这种方法可以在一定程度上降低样本空白而提高测定的准确性，但是该法并不能完全消除脂浊对测定结果的影响，特别是要注意样本稀释后由于基质效应而导致测定结果出现一定的误差。
2、乙醚抽提法：在高脂血样本中加入有机溶剂乙醚，震荡混匀后离心，可有效地将样本中的甘油三酯等脂溶物质萃取出来。但是由于该方法加入了新的化学物质，会对有些检验项目的测定产生影响。
3、沉淀分离法：该方法来源于沉淀法测定HDL，即联合使用磷钨酸-镁沉淀剂和聚乙二醇-硫酸葡聚糖沉淀剂，沉淀血清中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂蛋白（a），该方法对部分检验项目的测定会产生影响，且操作繁琐，因此该法也有一定的局限性。
4、干化学法：干化学分析仪是采用以Kubleka-Munk理论为主要理论基础的多层薄膜的固相试剂技术，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用反射光度法和基于离子选择电极（ISE）的差示电位法进行检测的一类新型仪器。当全血通过多层薄膜的固相时，血细胞、脂浊微粒等物质可以被阻截，因此该法亦可有效地去除脂浊对生化检验结果的干扰。
5、高速离心法：将脂浊血清加盖密封，经高速离心后，血清可以分成两层，吸取下层的血清进行临床生化测定，适用大部分临床生化测定指标的测定。但该法设备要求较高，中小医疗机构没有高速离心机，限制了该法的使用。
南京军区南京总医院检验科汪俊军主任：一般情况下都不做特殊处理，进行正常检测，但在报告中会注明：严重脂血及结果仅供参考，建议复查。ALT、AST、UREA少数项目无法测出结果；TP、CREA结果偏低；TBIL、DBIL结果偏高，必要时可以对样本进行稀释，但对结果会有影响。
大连市临床检验中心徐维家主任：脂血标本是临床常见的干扰原因，对比浊法和比色法的生化项目可以造成较大干扰。对不同的检测项目可以采用不同的处理方法来消除干扰。
1）常用的化学方法有乙醚提取法，经过乙醚处理的脂血标本虽然可以排除脂浊对于ALT、AST、TP、TBIL、DBIL、HBDH、CK-MB、Crea等指标的干扰，但是不能排除对ALB、GGT、LDH、BUN、GLU、CA等指标的干扰。生理盐水稀释法，是最常用的方法。还有沉淀分离法等。以上方法都需要注意基质效应的影响。
2）常用的物理学方法是高速离心法，高速离心法易于推广，注意可能会得到溶血标本。
3）干化学法较好，可以有效排除脂血的影响。
重庆市三峡中心医院生化科杜红心主任：遇严重脂血标本时，TG机外稀释，其它生化项目检测时我们用高速冷冻离心机，1-1.5万转/分处理，效果不错。
贝克曼库尔特：严重脂血的标本，实验室有条件应该进行超速离心分离后在检测；也可以进行稀释后再测，同时需要考虑稀释后浓度过低超出检测下限问题。
迪瑞：如方便，询问患者是否进食后采血，因为吃饭后尤其是摄入过多脂质食物时，大量的乳糜微粒会进入血液中形成脂血，干扰很多生化检测项目的测定。如果是体检或是慢性疾病患者建议严格空腹8小时后采血，如果是空腹采血患者或是急诊患者，应根据生化检测项目进行相应的去血脂处理，如超速离心法、血脂清除剂等。
在不具备清除血脂条件的基层实验室，脂血标本测试完应标注标本类型为脂血标本，并告知临床科室原因。
二、使用全自动生化分析仪时，如何正确理解测定过程中的自动监测反应的吸光度变化数值。还有对生化项目进行校准时，校准模式的正确选择。
汪俊军主任：吸光度的变化是在特定波长下测定某种物质的变化导致的，吸光度在反应过程中的变化，与检测的特定物质在整个反应过程中浓度的变化保持一致。
一般情况下，在仪器校准界面，空白校准选择Blank；一点终点法、两点终点法、连续监测法及部分比浊（少于两个浓度点）一般选择2 point；多于两个以上的浓度点选择多点校准（Full）。
徐维家主任：1、要了解吸光度的变化，首先要了解参数中主读点：M.DET.Pm/n，也就是Main Detect Point的简写，m和n是主读点区的起止点，0<m<n，也就是说m和n两点是在启动反应后的两个点，m点的读点必须设置，n可以不设置（填写0就是不设置），双试剂中是指R2加入之后的一组时间点，据此计算吸光度速率或平均值用于浓度计算。
2.定标方法：
1）K因素法 又称标准法或者线性法，当物质的浓度和吸光度成比例变化时采用该方法。
2）非线性法 又称曲线拟合法，当物质浓度和吸光度不成比例变化时使用该方法。
杜红心主任：使用全自动生化分析仪时，测定过程中的自动监测反应的吸光度变化数值最大用处在于观测是否有前滞反应。对生化项目进行校准时，校准模式应按试剂说明书选择。
贝克曼库尔特：自动生化分析对测定过程进行各种自动监测主要有以下几类：
1．试剂空白监测：每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：试剂空白的测定方法有两种：
①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。
②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
2．样本空白监测：由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
3．线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
4．底物消耗的监测：在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。主要用于避免因底物耗尽出现报告低浓度的假象。
校准模式的选择主要是生化反应类型来选择，其主要分为以下两类：
1. K因素法（又称标准化法或线性法）：当物质的浓度和吸光度成比例变化时选用该法。原理是用校准品进行反应，测定吸光度的大小或变化量，根据朗伯—比尔定理（浓度=因素*吸光度）计算出因素（K）的大小，测定待测物质吸光度，利用因素K可计算出待测物质浓度大小和活性大小。K因素法是应用最广泛的校准方法，用于常规生化检验项目的浓度或活性的分析。
2. 非线性法（又称为曲线拟合法）：当物质的浓度和吸光度不成比例变化时选用该法。其原理是使用多个（3-6）浓度的校准品，在选定波长测定其吸光度值，利用浓度和吸光度之间的关系绘制非
线性标准曲线。生化分析仪多采用Logit-log等方法进行拟合计算出曲线各常数。非线性法适用于免疫分析方法，如C-反应蛋白、类风湿因子、抗“O”和酸性糖蛋白等的测定。
一般生化试剂的参数设定中会有厂家推荐的校准模式。
迪瑞：1、生化分析仪的原理为紫外可见分光光度法，是根据测定样本、试剂的混合溶液的吸光度值或吸光度的变化率，用朗伯比尔定律来计算待测标本的浓度。通常生化分析仪都会有反应时间的限制，目前通用的反应时间为10分钟左右，即加入样本或R1试剂后测定第一个吸光度到反应液被吸走前最后一个吸光度为10分钟左右，因此在10分钟反应时间内，生化仪会根据没一个测光周期产生很多个吸光度测试值，如反应时间10分钟，测光周期为18秒，所以在整个反应时间内会产生10×60秒÷18≈33个周期，即产生33个吸光度值，在根据试剂设定的测定方法：速率法、终点法、固定时间法等，选取相应的吸光度值或吸光度的变化率用于计算。
2、通常生化仪校准模式分为以下几类：空白校准、线性校准和非线性校准。空白校准：主要目的是去除反应杯及光路空白的干扰，用于输入因数而无校准品的试剂。线性校准：应用最为广泛，大多数有校准品的比色法试剂，采用空白和校准品的两点校准。非线性校准：用于吸光度变化与浓度变化不成线性的比浊法试剂，采用3-6个校准品的函数校准方式。
三、脂肪肝、酒精性肝病有哪些特异性和灵敏度高的生化标志物？
汪俊军主任：非酒精性脂肪肝一般检查CHOL、TRIG、HDL-C、LDL-C、ALT、GGT等项目，通常有ALT、GGT的轻到中度增高（小于5倍正常值上限），通常以ALT增高为主。
酒精肝一般检查GGT、ALT、AST等项目，通常情况下GGT、ALT、AST均升高，但GGT升高更加明显。GGT灵敏度高，一般轻度的肝损伤即可引起GGT升高，但无特异性。
徐维家主任：脂肪肝是一种多种原因引起的疾病模式最常见的弥漫性肝病之一，首先是高脂血症，其次血清CHE活性明显增高是脂肪肝最突出的生化特征，GGT在酒精肝和脂肪肝时血清水平升高诊断的正确率为69%和55%，尤其在酒精性损伤肝细胞微粒体时升高较灵敏，非酒精性肝病ALT/AST比值大于1，酒精性脂肪肝ALT增高不明显，AST/ALT大于2有诊断意义。α1，α2-及β-球蛋白，铁蛋白，ApoA1及胆汁酸可见升高但并无特异性，除此之外还有ALP、TBIL、TG、LDL、CHOL均有不同程度的升高。
贝克曼库尔特：脂肪肝是指由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，为一种常见的临床现象，并非一种独立的疾病。由于有多种原因可引起脂肪肝，如肥胖、糖尿病、嗜酒等，因此在生化检测中也会表现出血脂紊乱、空腹血糖增高、血清转氨酶增高（主要以丙氨酸氨基转移酶增高为主ALT）。这些并非特异性的标志物，临床上主要是依靠影像学或病理学作为其诊断标准。
酒精性肝病是由于长期持续过量饮酒引起的肝脏损伤的病变。首选试验：1. 血浆乙醇测定；2. 血清谷氨酰转移酶（GGT）：乙醇对肝细胞线粒体的诱导导致GGT活性增高。
次选试验：血清转氨酶测定：临床上表现为转氨酶轻度升高，一般急性酒精性肝炎的转氨酶活性很少超过300U/L，慢性酒精性肝病可能会更低些（经常在参考区间内）。通常天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高更明显，AST/ALT>2，而其他肝脏疾病ALT通常要大于AST。
迪瑞：酒精肝：ALT、GGT、ALP联合检测，脂肪肝：ALT、TB、DB、TC、TG联合检测。
四、尿酸测定过程中，影响尿酸值比实际偏低的因素有哪些？
邱广斌主任：1、药物的影响。测定UA的方法有多种，主要有磷钨酸法和采用过氧化物酶偶联Trinder反应的UA氧化酶法。氧化酶法相对磷钨酸法具有较高的特异性和稳定性，方法简单，血清量少，快速等优点，为临床常规工作的首选方法。但这种方法易受还原性物质的负干扰，如一些药物。有研究发现，炎琥宁浓度超过4000mg/L时，对尿酸测定可引起明显的负干扰。如果使用了大量的炎琥宁或炎琥宁污染了标本就会使高尿酸血症出现正常结果，有必要停药后复查尿酸。
2、携带污染。试剂携带污染影响检测的原因包括：（1）一种试剂中含有另一试验的测定物质而直接干扰其测试结果；（2）一种试剂中含有改变另一试剂反应条件或影响其反应进程的物质而间接干扰其测试结果。由该试剂引导的反应对下一个项目的反应进程带来间接干扰。在有试剂污染的情况下，下一个项目所测定的是前后2个项目反应的综合作用结果。如CHE的R2试剂（硫代丁酰胆碱）对UA测定干扰。如果仪器的反应杯是塑料的，相比石英杯更具吸附污染。在2个测试项目间用去离子水清洗，如清洗不彻底一个项目对紧随其后的一个或几个项目测定会带来一定程度的试剂污染，并且随着仪器使用时间的累加及仪器状况的下降，试剂交叉污染的程度会有所加剧，就会影响测试结果的准确性。
3、维生素C的影响。维生素C具有强抗氧化作用，可以减少大量氧化中间产物的产生和减少炎症的发生，从而减少尿酸合成。同时，维生素C还具有还原性，会使在尿酸测定中产生的最终产物苯醌亚胺以及中间产物过氧化氢还原，所以就会对尿酸的测定产生干扰。
汪俊军主任：尿酸检测过程中，样本量加入不足、反应不完全、光源灯老化及反应温度未达到要求温度等因素均可导致检测结果偏低。
徐维家主任：VC、高浓度胆红素会导致尿酸偏低，标本在常温中长时间保存并且未及时分离会导致尿酸偏低，可能与细胞代谢有关。生化分析仪吸取试剂时吸取到气泡，或者取样量不足，混匀不好，反应杯污染本底过高，或者定标偏低也会导致测定值偏低。
杜红心主任：尿酸测定过程中，影响尿酸值比实际偏低的因素有：治疗水平的甲基多巴、氨基比林；血液中维C大于1.7MMOL/L时；血液中嘌呤产物可抑制尿酸反应。
贝克曼库尔特：如果检测标本尿酸含量过高，试剂线性范围较窄出现试剂反应物耗尽现象，会造成假阴性结果。很多情况是标本本身因素导致的偏低，如恶性血液肿瘤病人体内会含有分解尿酸的尿酸酶从而导致尿酸含量过低。
迪瑞：1、食物中摄入的含嘌呤食物较少，尿酸生成较少；2、肾脏系统发生病变时造成尿酸合成较少；3、服用别嘌醇、苯溴马隆等药物影响；4、在PH较高的碱性尿液中。
五、部分特定蛋白如类风湿因子与抗“O”等，用生化分析仪检测为什么不稳定？
邱广斌主任：临床检测特定蛋白多使用生化分析仪或特定蛋白分析仪，两者的检测原理不同。生化分析仪采用透射比浊法，是测定通过不溶性复合物到达探测器而未被散射或吸收的光线量，光通量与抗原含量成反比。特定蛋白分析仪采用散射比浊法，原理是一定波长的光沿水平轴照射，通过液体时遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物大小和多少密切相关，通过测定散射光的强度来反映被测成分的含量。相对而言，免疫透射比浊法的灵敏度不够理想，检测范围不够宽，原因是免疫复合物颗粒太小阻挡不了光线的通过；或是免疫复合物的数量太少，其浊度变化对光通量的透过影响不大，特别是在低浓度时更加明显。而在抗原过量情况下，透射比浊法易出现钩状效应而导致结果偏低。而在速率散射比浊法检测时，仪器设计有抗原过量检测系统，抗原过量时会提示样本稀释，从而达到检测结果的准确性和精密度。由此，在比较实验中，速率散射比浊法在低浓度和高浓度测定中可以得到较为准确的结果。
汪俊军主任：类风湿因子和抗O检测一般采用免疫比浊法，通过抗原抗体之间反应形成免疫复合物，通过检测吸光度的变化，计算被测物浓度。目前检测多用特定蛋白仪，较生化分析仪，有以下优点：1、正常实验之外有预反应（前）或抗原过量检测试验（后），避免假阴性结果。2、反应杯清洗方式不同，生化仪清洗程度可能不能彻底清洗反应物残留。
徐维家主任：生化分析仪使用的是透射免疫比浊法，是利用抗体与可溶性抗原的反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒，然后进行浊度光密度值检测，该方法由于是检测浊度，极易受到本底的影响，血清的黄疸溶血和脂血的状态都会影响检测结果，且抗原抗体反应容易存在抗原或者抗体过剩引起的钩状效应，只能检测到分子量较大的蛋白，测定范围较小，灵敏度差，部分国产试剂采用的是增强胶乳试剂，存在沉淀和混匀状态不好等影响因素，更是导致了结果不稳定。试剂在机时间也不宜过长。
杜红心主任：部分特定蛋白如类风湿因子与抗“O”等，用生化分析仪做不稳定的主要原因在于：试剂质量差。特定蛋白生化试剂常采用胶乳增强免疫凝集法，这要求胶乳试剂（通常是R2）在机内一定时间（如一周）不分层、不沉淀，始终保持匀相状态。部份品牌试剂达不到这一要求。我选择这类试剂时，把R2试剂倒入试管中，3000转/分离心10分钟，如试管底部无沉淀物，这个试剂应该说是稳定可用的。R2试剂上机时选用容量较大的试剂盒，便于机器运行时对R2试剂有一定混匀作用。
迪瑞：因为RF与ASO项目在生化分析仪上所采用的检测方法为免疫透射比浊法。原理为抗原抗体结合后形成免疫复合物，随着不同浓度的抗原或抗体的加入，形成的免疫复合物会产生相应趋势的浊度，这时候通过生化分析仪的光学系统测定免疫复合物的浊度以吸光度的方式呈现，再根据非线性校准形成的校准曲线带入公式进行计算。
但是受到以下几个方面的制约，导致RF、ASO在生化仪上不稳定：
1、由于很多试剂厂家为了增加试剂的灵敏度，在试剂中加入了胶乳颗粒，胶乳颗粒和试剂中的抗原或抗体会随着试剂开封后使用的时间出现浓度跌落、失效、分层等现象，因此免疫比浊法试剂在开封效期较其他试剂短，操作人员要及时定标和更换试剂，保证测试的准确。
2、因为生化仪在测定较低值时，生化仪的灵敏度对于免疫比浊法影响较大，在很小浊度产生时，受灵敏度的制约很难检测到，因此低值标本在生化上检测不是很理想。
3、由于RF、ASO等采用非线性校准模式，需要5-6个校准品进行校准，易产生随机误差，校准是否理想对结果至关重要，因此上述两项在生化仪上要经常性校准保证结果稳定。
转自临床实验室

学习了 多谢老大

学到好多知识，谢谢老大。

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郑老师知识就是渊博啊，不愧大师级啊

stonesam 发表于 2015-4-12 21:21
郑老师知识就是渊博啊，不愧大师级啊

这不是我写的，分享的，最后有杂志出处。

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