| 生化分析仪基础知识 |
| 随着人们对生命科学的认识不断提高，越来越多的与生命相关的物质及其在生命活动中所起的作用已被人们所认识。因此，在医学检验中产生了针对不同种类的生命物质的检验、寄生虫学检验、遗传学检验、真菌学检验、体液分泌物及排泄物检验等。不同的检验内容所涉及到的医学检验方法有所不同。这里我们所提到的“方法学”仅仅是生物化学检验中所涉及的实验方法，它只是医学检验方法的一个具体方面，并不代表医学检验方法学。 |
| 面对繁多而复杂的生命物质如何进行检测？这就是医学检验的目的所在。几乎所有的生命物质都不能直观地被检测出来，需要直接或间接借助于不同的技术和手段。随着科学的发展，越来越多的技术和方法被应用于医学检验。比如光度法、电位分析法、电泳技术、层析技术等。 |
| 一、光度法 |
| 临床检验中常利用发射光谱或吸收光谱的强度来测定体液或组织中某一成分的含量，这类分析方法统称光度法。其中，应用吸收光谱原理进行分析的有可见光分光光度法、紫外光分光光度法、红外光分光光度法和原子吸收分光光度法。由于许多物质的溶液是有颜色的，更多的物质虽然本身无色，但在一定条件下，能与试剂作用，形成有色化合物质。而生化分析仪就是利用比较液体颜色的深度以进行物质含量的测定，因而又称为比色分析法。应用发射光谱原理进行分析的有火焰光度法、荧光光度法和化学发光法。临床检验中有时用到的比浊法，除了光的吸收外还有光的散射因素。目前的生化分析仪仅仅是一种利用分光光度计技术，辅以简单的控制和计算手段来达到医学检验目的。 |
| 在分光光度法中，我们应了解什么波长范围的光最常用，哪些化学物质可以用这种方法进行分析。也就是说，欲测定一复杂溶液中某些物质的浓度，就必须先了解该物质在哪一波长范围内对光有最大吸收，同时还必须了解在哪一波长范围内该物质的量与光吸收量之间有可靠的定量关系。 |
| 光是一种电磁波。人的眼睛所能感觉到的波长约由400nm的柴紫色到760nm的红色，这段波长以外的光就无法看见，因而400－760nm之间的光波称为可见光。短于400nm的叫紫外光，短于200nm的叫远紫外线，再短的就是X射线与γ射线。长于760nm的叫红外线，再长的就是微波和无线电波。在电磁波谱中，X射线与γ射线的频率极高，含有能量较高的量子。当这种辐射作用于物质时可使物质的分子结构破坏，而且这种破坏是不可逆的。如果用这些射线作为分析手段，无法得到所要的结果。所以X射线与γ射线在生化检验中无法使用。紫外光和可见光的频率稍低于X射线，它们所携带的能量较小。从对物质的作用来说，紫外光和可见光没有区别。当这两种辐射作用于物质时不会破坏物质的分子结构，所以这两种光在医学检验中得到广泛应用。红外光在有机化合物的定性分析中有很大意义，它是光谱学家和生物学家研究分子构造的有力工具。但是，进行红外光谱分析的首要条件是所用样品必须是纯品，而在临床检验中所处理的样品大多数为复杂的混合物，要想得到纯品难度很大，所以红外光在医学检验中的应用受到很大的限制。 |
| 二、光吸收基本定律 |
| 光吸收基本定律即朗伯－比尔（Lambert－beer），公式为：A＝KCL，其中吸光度A＝－lg（I/I0），I0为入射光强度，I为出射光强度，L为比色池厚度。如果浓度以mol/L为单位，液层厚度以cm为单位，此时的K称为摩尔消光系数，用ε表示。其意义是1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时的吸光度。不同物质的摩尔消光系数不同。ε越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强。可见影响吸光度的主要因素有三种，即浓度、光程及波长。在光程及波长都不变的情况下，吸光度就只与浓度有关了。 |
| 三、实验方法 |
| 光谱技术中的可见、紫外吸收光谱法是各类生化分析仪对反应过程所应用的分析原理，即都是通过检测一定波长下某一发色基团吸光度的变化，辅以微机软件系统的计算而完成的。可见、紫外吸收光谱法是根据物质分子对于200－700nm光区电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。其主要特点包括：灵敏度高、选择性强，由于组份的分子结构不同，它们的吸收光谱也不同，可对生物样品中的单组份 或多组份进行分析、精密度和准确度高。可见、紫外吸收光谱法定量测定试样中一个或几个组份含量的基础是Lambert－Beer定律。该定律是说明吸光物质对单色光吸收的强弱与该物质的浓度之间的关系。定律经数学推导可表达为：A＝－lgT＝εCL，式中：ε－吸光系数，在给定条件下为物质的特性常数；T－透光率，C－待测物浓度，L－比色池厚度。该式说明了吸光度与浓度之间的简单正比关系。 |
| 生化分析仪就是利用光吸收的基本定律来检验各种溶液的浓度指标的一种分析仪器。在光路设计方面，有前分光和后分光两种。所谓前分光，是指在光源灯和样品之间用滤光片、棱镜或光栅进行波长选择，取得与样品“互补”的单色光之后，照射到样品上，再用一个光电池或光电管作为检测器，测定样品对单色光的吸收量（吸光度）。而后分光则是将一束白光（混色光）先照到样品上，然后再分光。 |
| 由于待测样品与试剂反应的性质不同，所使用的信号采集方法也有所不同。归纳起来主要有终点法、动态法和两点法。 |
| 1、终点法：指经过一段时间的反应，反应达到平衡，反应液的吸光度不再变化，只与被测物的浓度有关。这类方法通常称为“终点”法。实验证明，有色物质溶液的颜色深度与其浓度有关。溶液的浓度越大，则所显示的颜色越深。所以在比色分析中必须选择合适的显色条件和比色条件。显色条件的选择一般应严格按照试剂单的要求进行。比色条件的选择主要是选择合适的滤光片。即滤光片透光率最大的光波应当是溶液透光率最小的光波，也就是说滤光片的颜色与溶液的颜色互为补色，因为有色溶液对它的互补色具有最大的吸收。 |
| C＝C标准×（A样品－A空白）/（A标准－A空白） |
| 式中C标准/（A标准－A空白）的值即为因数F值。应当注意的是，标准物的吸光度测定值与试剂空白吸光度之间应有一定的差距。差值越大，敏感度越好，误差就越小。 |
| 有的生化项目，除了需做试剂空白外，还需做样品空白，当然也包括标准空白。最后应从样品、标准及试剂吸光度中减去各自的空白值，计算如下： |
| C＝C标准×［（A样品－A样品空白）－（A试剂－A试剂空白）］/［（A标准－A标准空白）－（A试剂－A试剂空白）］ |
| 还有个别的生化项目，有干扰成分存在。为了消除实验的干扰，采用双波长进行测量。此方法的关键是如何选择二个测定波长λ1和λ2。选择的原则是：使干扰组份在这两个波长处的吸光系数相等，而待测组份在这两个波长处吸光系数有显著的差别。 |
| 2、动力学法：又称零级动力学法，指反应速度与底物浓度的零次方成正比，也就是与底物浓度无关。因此，在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度(ΔA/min)与被测物的活性或浓度成正比。动力学法也被称为连续监测法或速率法；主要用于酶活性的测定。酶是由生物体产生并能在体内外起催化作用的一类特殊蛋白质，体内几乎所有的代谢反应都是在不同的酶催化下进行的。酶的催化效率很高，而且非常不稳定。人体内酶浓度的变化能反映出许多疾病。同时酶的含量又很低，除免疫学方法外，不能直接测定其含量，只能测其催化反应过程中一定时间内物质变化的量，即酶促反应的速率，或称酶的活力。通过测定底物浓度的下降或产物浓度的上升，可以追踪酶促的反应过程中底物转化为产物的过程。酶促反应过程可分为几个时期。化学反应的初始阶段，底物和产物的变化不明显，此期在几秒到几分钟，称为延迟期；随后是底物和产物变化与时间成直线的时期，形成产物的速率恒定，称为零级反应期；接着是反应速率持续下降，进入一级反应期。 |
| C＝ΔA×F＝ΔA×Vt/Vs×1000/ε，式中，C表示酶活力浓度，单位是U/L，F为换算因子，ε为毫摩尔消光系数，Vt为总反应量，Vs为样品量，ΔA为每分钟吸光度的变化量。 |
| 在动态法测试中，还有一项很重要的参数，即非线性，用于监测反应的线性程度。 NL＝（ΔA1－ΔA2）/ΔA/2×100％，式中ΔA1为测量时间前半段吸光度的变化量，ΔA2为测量时间后半段吸光度的变化量，ΔA为测量时间内吸光度总的变化量。 |
| 3、固定时间法：又称为一级动力学法、二点动力学法等，属于带标准的速率法，是动态法的另一种形式。指在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比，即v=k[S]。由于底物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必需经过一段延迟时间才能进入稳定反应期。 |
| C＝(A样品2－A样品1）/(A标准2－A标准1）×C标准 |
| 四、分析仪在测定某个项目时所用的分析方法是根据该项目所用的试剂和方法学而决定的。对于有酶参与的反应，不论采取以上哪种方法，都要符合两个原则，即：1、在零级反应期测定。2、反应速度与酶量呈线性关系。在测定某一酶活力时，还要考虑影响该酶反应的因素，如：底物浓度、ph、温度和样品中干扰物质等因素。 |
| 近年来，酶学分析用于生化项目检测越来越普遍，其主要原因是由于酶的特性以及工具酶的使用。酶的特性决定了酶学分析方法具有高效、专一、温和、灵敏的特点，可实现在一个混和的样品中直接测定所要测定的成分。 |
| 由于许多酶促反应中的底物和产物的变化很难通过化学或物理的方法直接监测，故需在反应中加入一些能与产物作用但又不干扰这个酶促反应的试剂，这些试剂主要为酶试剂及底物，使第一个酶促反应的产物转变成易被监测的第二或第三个酶促反应的产物。通过这种酶偶联反应，间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测物的活力。作为试剂用于测定化合物浓度或活力的酶称为工具酶。用于辅助工具酶，联系待测物和工具酶的称为辅酶。一般辅酶都是可被仪器直接监测到的物质。最常用的工具酶是乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶，最常用的辅酶是NAD或NADP或它们的还原型。NADH或NADPH在340nm波长处有特征性光吸收，工具酶和辅酶的应用使酶学分析包括两方面的内容：1、借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、尿素、肌酐、胆固醇等等：2、借助酶来测定另一种酶的活力，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。 |
雄起
