[转发]生化小常识--sysmex

何谓生化检测的基质效应？怎样评估基质效应？该如何避免基质效应的发生？ 临床生物化学分析中基质效应，已日益受到重视。最早是在酶活力测定中用人工制备的参考物质时发现。在酶法分析与免疫化学分析中，普遍存在的基质效应影响了定量测定的准确性。 按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件的定义，“基质效应”（matrixeffect）是指：①标本中除分析物以外的其它成分对分析物测定值的影响；②基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义来说，基质效应也应包括已知的干扰物（胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差（matrix bias）。用作校准物质或质控物，经过处理的混合血清，由于血清机制的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。 在基质效应的评估方法方面，通常认为测定新鲜（或冰冻）血清无基质效应，决定性方法或参考方法也无基质效应。参考访法与常规方法测定同一批新鲜血清的结果一致，表示这项常规方法没有方法误差，如有差异则代表常规方法的“校准偏差”（calibration bias）。用参考方法与常规方法测制备物（如室间质评样品）时往往得不一致结果，这种差异称作调查偏差（survey bias）。调查偏差与校准偏差之差即基质偏差。 减少基质效应的主要措施包括： 1、改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清； 2、改进仪器设计及试剂组成； 3、选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。 王达 二、目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是什么？与其它常用检测方法比较，有何优越性？ 目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是己糖激酶-UV法（HK-UV法），其测定原理是： 标本中的葡萄糖在ATP的存在下，由己糖激酶的作用生成6-磷酸葡萄糖（G-6-P），G-6-P又在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）的作用下，并且在氧化型（NADP）的存在下，转变成6-磷酸葡萄糖酸，此时在波长330~350nm（或采用主波长330~350nm，副波长405~800nm的双波长测定法）下测定生成的还原型（NADPH）的增加量，求出葡萄糖浓度。 [参考值] 血清：3.3~5.6 mmol/L（60~100 mg/dL） 与常用的葡萄糖氧化酶法（GOD法）比较，其优越性主要表现在： 葡萄糖氧化酶法（SOD法）特异性催化β-D-葡萄糖。而葡萄糖α和β构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须使α-葡萄糖变旋为β-构型。国外某些商品试剂中含有变旋酶，可加速变旋过程。也可通过延长孵育时间，自发性变旋完成转化。结果的准确性必然受到影响。 SOD法中，第二步过氧化物酶反应特异性低，一些还原性物质，如尿酸、维生素C、胆红素、血红蛋白、四环素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争H2O2 ，从而消耗反应过程中所产生的H2O2，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。 己糖激酶法是目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法，该法通常用终点法测定，反应迅速，适合于各种生化分析仪。 己糖激酶法基本不受溶血、脂血、黄疸、尿酸、维生素C及药物的干扰，其准确度和精密度相对较高。 三、血清碱性磷酸酶（ALP）测定的常用方法有几种，它们之间有何差别？ 正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一 半。其各自含量与年龄密切相关，但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP，特别是血型为分泌型B型或O型的人。 现已知人体含4型ALP同工酶，即肠型（IALP）、胎盘型（PALP）、生殖细胞型（GALP）和非特异组织型（TUALP）ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。 [临床意义] 肝胆疾病，尤其是阻塞性黄疸患者，该酶活性显著升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。 [测定原理] 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 [常用测定方法] 测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度，特别是缓冲液种类的影 响，目前，世界范围内生化试剂主要生产厂家，生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用，并可作为磷酸的受体参与反应，因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中，二乙醇胺（DEA）的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）的激活作用更强。因此用不同缓冲液测定的ALP活性，其参考值不同。 不少国家，包括我国，多采用AMP或DEA做缓冲液，但这两类物质不易提纯， 前者常混有5-氨基-3-吖-2，2，5-三甲基乙醇，后者易含一乙醇胺，均对ALP有抑制作用。故日本学者建议采用2-乙氨基乙醇缓冲液，而德国学者建议使用甲基葡萄糖胺缓冲液，此类试剂纯度高，不含抑制ALP活性的物质，可不加螯合剂，其pK值高于DEA。根据所使用的激活型缓冲液不同，常用的检测方法主要有四种： IFCC推荐方法：AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃ JSCC推荐方法：EAE（2-乙氨基乙醇）缓冲液 正常参考范围：115~359 U/L，37℃ GSCC推荐方法：DEA（二乙醇胺）缓冲液 正常参考范围：80~260 U/L，37℃ DSKG推荐方法（新GSCC方法）：MEG（N-甲基-D-葡萄糖胺）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃ 注：作为IFCC推荐的方法，IFCC有关专家也在考虑，ALP测定时所使用的缓冲液是否应该更换。目前SYSMEX公司在国内销售的是采用JSCC推荐方法的检测试剂盒，而采用IFCC推荐方法的检测试剂盒正在办理注册证，近期也将上市。

生化应用小常识（一）

王达

一、血清碱性磷酸酶（ALP）测定的常用方法有几种，它们之间有何差别？ 正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一半。其各自含量与年龄密切相 关，但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP，特别是血型为分泌型B型或O型的人。 现已知人体含4型ALP同工酶，即肠型（IALP）、胎盘型（PALP）、生殖细胞型（GALP）和非特异组织型（TUALP）ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。 [临床意义] 肝胆疾病，尤其是阻塞性黄疸患者，该酶活性显著升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。 [测定原理] 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在405nm测定对硝基苯酚生成 的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 [常用测定方法] 测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度，特别是缓冲液种类的影响，目前，国际上生化试剂主要生产厂家，生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用，并可作为磷酸的受体参与反应，因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中，二乙醇胺（DEA）的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）的激活作用更强。因此用不同缓冲液测定的ALP活性，其参考值不同。 不少国家，包括我国，多采用AMP或DEA做缓冲液，但这两类物质不易提纯，前者常混有5-氨基-3-吖-2, 2,5-三甲基乙醇，后者易含一乙醇胺，均对ALP有抑制作用。故日本学者建议采用2-乙氨基乙醇缓冲液，而德国学者建议使用甲基葡萄糖胺缓冲液，此类试剂纯度高，不含抑制ALP活性的物质，可不加螯合剂，其pK值高于DEA。根据所使用的激活型缓冲液不同，目前常用的检测方法主要有四种： 1、 IFCC推荐方法：AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃ 2、 JSCC推荐方法：EAE（2-乙氨基乙醇）缓冲液 正常参考范围：115~359 U/L，37℃ 3、 GSCC推荐方法：DEA（二乙醇胺）缓冲液 正常参考范围：80~260 U/L，37℃ 4、 DSKG推荐方法（新GSCC方法）：MEG（N-甲基-D-葡萄糖胺）缓冲液 正常参考范围：45~130 U/L，37℃ 二、甘油三酯（TG）常用测定酶法中，为什么采用推荐方法—去除游离甘油的二步酶法优于一步酶法？ 血脂异常是动脉粥样硬化性疾病的重要危险因素之一，甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、高密度与低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C与LDL-C）是四项基本指标。临床上制定四项血脂的合适水平或异常水平的划分标准、治疗指针及治疗目标，必须在血脂测定结果准确性的基础上进行。由于TG的脂肪酸组成复杂，而且血中还有游离甘油与不完全甘油酯，使TG测定的结果的准确性显得尤其重要。TG测定的常规方法，国内普遍采用甘油磷酸氧化酶法，也是检验学会的推荐方法，但目前因为商品试剂大都未用二步酶法去除游离甘油，这对多数住院病人是不合适的。 [测定原理] 标本中的游离甘油经第1试剂中甘油激酶（GK）作用，最后生成过氧化氢，再经过氧化氢酶分解成H2O，使游离甘油的影响被消除；另外，维生素C由维生素C氧化酶去除。第2试剂中TG等经脂蛋白脂酶（LPL）等作用所产生的过氧化氢，在POD的作用下，使4-氨基安替比林（4-AA）与HDAOS发生氧化缩合，生成紫色的醌色素，通过测定该色素的增加，求出TG浓度。以SYSMEX公司生产的二步酶法TG测定试剂盒为例： 第一步反应： 抗坏血酸 + 1/2O2 AOD 脱氢抗坏血酸 + H2O 游离甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO 磷酸二羟丙酮 + H2O2 H2O2 过氧化氢酶 H2O + 1/2O2 第二步反应： 甘油三酯 + 3H2O LPL 甘油 + 3分子游离脂肪酸 甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO磷酸二羟丙酮 + H2O2 2H2O2 + 4-AA + HDAOS POD 醌类染料 [参考值 ] 高甘油三酯血症： 1.69mmol/L以上（150mg/dL以上）。 [说明] 现阶段允许一步酶法与两步酶法并存，要求逐步过渡到统一采用两步法。在未统一方法前，实验室报告TG测定结果时应注明“去FG值”或“未去FG值”，这将有助于临床医生对结果的正确判断。 正常人血清FG浓度平均约0.11mmol/L(10mg/dl)，在糖尿病、服用含甘油的药物、静脉营养、情绪应急、血标本污染时，FG将明显增高，以致影响对TG水平的判断。 国外学者建议：临床实验室应备有可以去FG空白的试剂，供必要时采用；糖尿病及特殊门诊以及TG>2.3mmol/L者，最好作FG空白校正。

碱性磷酸酶（ALP）试剂盒—AMP法

Reagent for AIKaline Phosphatase Test

使用说明书

规格：

R₁ 3× 60ml R₂ 1× 45ml 7170瓶型

R₁ 2× 90ml R₂ 1× 45ml 7060瓶型

R₁ 4× 50ml R₂ 1× 50ml 7020瓶型

R₁ 2× 40ml R₂ 2× 10ml 普通 瓶型

用途：

本试剂用于测定血清或血浆中碱性磷酸酶活力。适用于半/全自动生化分析仪。

原理：

磷酸对硝基苯酚＋H₂O ­对硝基苯酚＋磷酸

试剂盒组成：

R₁： 缓冲液

AMP 1000mmol/L

MgCl₂ 0.5mmol/L

R₂： 启动液

磷酸对硝基苯酚（P-NPP） 10.0mmol/L

样品要求：

样品为空腹血清、血浆（肝素抗凝，0.1mg肝素可抗凝1.0ml血液）。样品应在低温条件下运输保存，样品中ALP在2～8℃可稳定6天。

测定步骤：

1. 基本参数：

方 法：速率法 样品/试剂：1/50

主波长： 405nm 反应温度： 37℃

副波长： 505nm 反应时间：10min

2. 操作：

2.1 两步法：

样 品	0.02ml
试剂R1	0.80ml
混匀，37℃恒温5分钟
试剂R2	0.20ml

混匀，37℃恒温1分钟后测定初始吸光度，然后准确测定平均每分钟吸光度变化值△A/min。

操作流程图：

空白管调零 ←——测定——→

Time： 5分钟 10分钟

37℃ 主波长405nm

↑ ↑ 副波长505nm

试剂R₁：0.80ml 试剂R₂ ：0.20ml

样 品：0.02ml

2.2 一步法：

工作液配制：根据测定所需试剂量，取R₁和R₂按4:1比例混合即为工作液。此工作液密闭避光贮存2～8℃可稳定21天，室温可稳定5天。

样 品	0.02ml
工作液	1.00ml

混匀，37℃恒温1分钟后测定初始吸光度，然后准确测定平均每分钟吸光度变化值△A/min。

计算：

样品AKP活力（U/L）=

理论K值：

性能指标：

1. 线性范围：0～858U/L（37℃），γ≥0.99。

2. 精密度：批内、批间平均CV分别为5.2%、6.3%。

3. 准确度：不准确度≤15%

4. 空白吸光度：试剂工作液在405nm处，10mm光径下，吸光度应小于1.500。

校准及质控：

1. 建议使用Roche Cfas复合校准品进行校准。

2. 推荐使用四川迈克科技公司提供的液体即用生化质控血清水平Ⅰ（正常）/水平Ⅱ（异常）进行室内质控。

注意事项：

1. 如果样品中AKP活力超过858U/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。

2. 试剂与样品用量可根据需要按比例改变。

3. 试剂使用后立即关紧瓶盖，避免污染。

4. 试剂变混浊或空白吸光度值大于1.500时，将不能使用，应弃去。

贮存：

本试剂密闭避光贮存2～8℃稳定12个月。

工作液密闭避光贮存2～8℃稳定21天，室温稳定5天。

参考值范围：

40～150U/L（37℃）

建议各实验室建立自己的参考值范围。

甘油三酯（TG）试剂盒—GPO-PAP法

Reagent for Triglycerides Test

使用说明书

规格：

R₁ 3× 60ml R₂ 1× 45ml 7170瓶型

R₁ 2× 90ml R₂ 1× 45ml 7060瓶型

R₁ 4× 50ml R₂ 1× 50ml 7020瓶型

R₁ 2× 40ml R₂ 2× 10ml 普通 瓶型

用途:

本试剂用于测定血清、血浆中甘油三酯含量。适用于半/全自动生化分析仪。

原理:

甘油三酯＋H₂O 甘油＋脂肪酶

甘油＋ATP 甘油-3-磷酸＋ADP

甘油-3-磷酸＋O₂ 磷酸二羟丙酮＋H₂O₂

H₂0₂＋4-AAP＋4-氯酚 醌亚胺＋H₂O

试剂盒组成:

R₁： 显色剂

缓冲液 0.10mmol/L

4-氯酚 2.20mmol/L

R₂： 酶试剂

GK ≥ 1.50KU/L

POD ≥12.50KU/L

4-AAP 1.30mmol/L

ATP 1.80mmol/L

MgCl₂ 12.50mmol/L

STD：甘油三酯校准液 2.26mmol/L

样品要求：

样品为空腹血清、血浆（肝素抗凝，0.1mg肝素可抗凝1.0ml血液；EDTA抗凝，1.8mgEDTA可抗1.0ml血液）。样品应在低温条件下运输保存，样品中TG在2～8℃保存可稳定3天，冰冻保存可稳定6个月。

测定步骤：

1. 基本参数：

方 法：终点法 样品/试剂：1/100

主波长： 505nm 反应温度： 37℃

副波长： 660nm 反应时间： 10min

2. 操作：

2.1 二步法：

	测定（U）	校准（S）	空白（B）
样 品（ml）	0.01	--	--
校准液（ml）	--	0.01	--
蒸馏水（ml）	--	--	0.01
试剂R1（ml）	0.80	0.80	0.80
混匀，37℃恒温5分钟
试剂R2（ml）	0.20	0.20	0.20

混匀，37℃恒温5分钟，505nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。

操作流程图：

蒸馏水调零 ←——测定——→

Time： 5分钟 10分钟

37℃ 主波长505nm

↑ ↑ 副波长660nm

试剂R₁：0.80ml 试剂R₂：0.20ml

样 品：0.01ml

2.2 一步法：

工作液配制：根据测定所需试剂量，取R₁和R₂按4:1比例混合即为工作液。此工作液密闭避光贮存2～8℃可稳定7天。

	测定（U）	校准（S）	空白（B）
样 品（ml）	0.01	--	--
校准液（ml）	--	0.01	--
蒸馏水（ml）	--	--	0.01
工作液（ml）	1.00	1.00	1.00

混匀，37℃恒温10分钟，505nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。

计算：

样品TG含量（mmol/L）=

校准及质控：

1. 建议使用四川迈克科技公司提供的TG校准品或Roche Cfas复合校准品进行校准。

2. 推荐使用四川迈克科技公司提供的液体即用生化质控血清水平Ⅰ（正常）/水平Ⅱ（异常）进行室内质控。

性能指标：

1. 线性范围：0.00～10.00mmol/L，γ≥0.99。

2. 精密度：批内、批间平均CV分别为4.1%、5.1%。

3. 准确度：不准确度≤10%

4. 空白吸光度：试剂工作液在505nm处，10mm光径下，吸光度应小于0.150。

注意事项：

1. 如果样品中TG含量超过10.00mmol/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。

2. 试剂与样品量可根据需要按比例改变。

3. 试剂使用后立即关紧瓶盖，避免污染。

4. 试剂变混浊或空白吸光度值大于0.150，将不能使用，应弃去。

贮存：

本试剂密闭避光贮存2～8℃稳定12个月。

工作液密闭避光贮存2～8℃稳定7天。

参考值范围：

0.34～1.92mmol/L

建议各实验室建立自己的参考值范围。

葡萄糖（Glu）试剂盒—GOD-PAP法

Reagent for Glucose Test

使用说明书

规格：

R₁ 3× 60ml R₂ 1× 45ml 7170瓶型

R₁ 2× 90ml R₂ 1× 45ml 7060瓶型

R₁ 4× 50ml R₂ 1× 50ml 7020瓶型

R₁ 2× 40ml R₂ 2× 10ml 普通 瓶型

用途:

本试剂用于测定血清、血浆中葡萄糖的含量。适用于半/全自动生化分析仪。

原理:

β-D-葡萄糖＋O₂＋H₂0 D-葡萄糖酸＋H₂O₂

H₂O₂＋4-AAP＋酚 2H₂O＋红色醌类化合物

试剂盒组成:

R₁： 显色剂

酚 12.0mmol/L

R₂： 酶试剂

GOD ≥35KU/L

POD ≥ 5KU/L

4-AAP 1.20mmol/L

STD：葡萄糖校准液 5.55mmol/L

样品要求：

样品为空腹血清、血浆（肝素抗凝，0.1mg肝素可抗凝1.0ml血液；EDTA抗凝，1.8mgEDTA可抗1.0ml血液）。样品应在低温条件下运输保存。

测定步骤：

1. 基本参数：

方 法：终点法 样品/试剂：1/100

主波长： 505nm 反应温度： 37℃

副波长： 660nm 反应时间： 10min

2. 操作：

2.1 二步法：

	测定（U）	校准（S）	空白（B）
样 品（ml）	0.01	--	--
校准液（ml）	--	0.01	--
蒸馏水（ml）	--	--	0.01
试剂R1（ml）	0.80	0.80	0.80
混匀，37℃恒温2分钟
试剂R2（ml）	0.20	0.20	0.20

混匀，37℃恒温8分钟，505nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。

操作流程图：

蒸馏水调零 ←————测定————→

Time： 2分钟 10分钟

37℃ 主波长505nm

↑ ↑ 副波长660nm

试剂R₁：0.80ml 试剂R₂ ：0.20ml

样 品：0.01ml

2.2 一步法：

工作液配制：根据测定所需试剂量，取R₁和R₂按4:1比例混合即为工作液。此工作液密闭避光贮存2～8℃可稳定1个月，室温可稳定7天。

	测定（U）	校准（S）	空白（B）
样 品（ml）	0.01	--	--
校准液（ml）	--	0.01	--
蒸馏水（ml）	--	--	0.01
工作液（ml）	1.00	1.00	1.00

混匀，37℃恒温10分钟，505nm波长，以空白管调零，测定各管吸光度。

计算：

样品Glu含量（mmol/L）=

校准及质控：

1. 建议使用四川迈克科技公司提供的Glu校准品或Roche Cfas复合校准品进行校准。

2. 推荐使用四川迈克科技公司提供的液体即用生化质控血清水平Ⅰ（正常）/水平Ⅱ（异常）进行室内质控。

性能指标：

1. 线性范围：0.00～22.30mmol/L，γ≥0.99。

2. 精密度：批内、批间平均CV分别为3.6%、4.7%。

3. 准确度：不准确度≤5%

4. 试剂空白吸光度：试剂工作液在505nm处，10mm光径下，吸光度应小于0.150。

注意事项：

1. 如果样品中Glu含量超过22.30mmol/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。

2. 试剂与样品量可根据需要按比例改变。

3. 试剂使用后立即关紧瓶盖，避免污染。

4. 试剂变混浊或空白吸光度值大于0.150，将不能使用，应弃去。

贮存：

本试剂密闭避光贮存2～8℃稳定12个月。

工作液密闭避光贮存2～8℃稳定1个月，室温稳定7天。

参考值范围：

3.89～5.56mmol/L

建议各实验室建立自己的参考值范围。