[转发]核酸荧光染色技术在血液分析仪的最新应用

核酸荧光染色技术在血液分析仪的最新应用

吴俊 一概述 目前，五分类血液分析仪已经为许多大中型医院实验室所使用。五分类仪器不同于三分类仪器的主要区别在于：为了精确定量地检测白细胞的五种成份，各种五分类血液分析仪开始采用多种物理学原理（电阻抗、光散射、高频波技术），甚至设置专用检测通道和化学染色方法检测数目最少的嗜酸、嗜碱性粒细胞。 而高档次的五分类血液分析仪，除了检测正常白细胞五项分类以外，还致力于高灵敏地检测幼稚、异常成份。对于外周血中的幼稚成份，过去一般依赖于显微镜镜检。而普通血液分析仪对异常标本报警的灵敏度有限，常常造成漏报。或者为了减少这种情况而提高阳性报警率（通过降低仪器报警的阈值），提高了复片的比例从而造成假阳性率偏高，失去了过筛的意义。鉴于以上这些问题，SYSMEX近年来开始致力于通过化学染色方法对幼稚成份的标本进行自动化检测，这相对于一般的阳性报警（即提供一种可能性）要进步了很多。 对于红细胞系统，幼稚成份主要是网织红细胞和有核红细胞检测，提供定量的参数甚而可以对RET成熟度作进一步的分类。在白细胞中，幼稚成份根据形态学的不同包括原始细胞、核左移细胞、幼稚粒细胞、异常/异型淋巴等。能否采用特殊的方法学（如核酸染色方法）高灵敏度地测得幼稚白细胞的存在，甚至提供定量的参数，是仪器优劣的标志之一。除了幼稚细胞以外，其它一些异常标本的检出率和准确性也通过技术的进步而得到提高。对于巨大血小板、血小板凝集、小红细胞或细胞碎片等标本，使用传统的电阻抗原理往往无法准确测的，而新的核酸染色技术结合光学流式原理则可以较好地解决。因此，可以灵敏、准确地检测出幼稚的红、白细胞存在（而非提供可能性），并具有血小板的形态辨识功能，成为血液分析仪发展的最前沿的功能。 二 核酸荧光染色技术 在白细胞系分析的应用 a.正常五项分类的分析应用 由于电阻抗原理的局限性，二分群、三分群仪器都无法准确地检测出淋巴、单核、嗜酸性、嗜碱性、嗜中性细胞。为了能够从细胞体积大小到内部结构全面分析细胞并得到准确的白细胞分类结果，各种型号的五分类仪器采用了各项技术联合应用于血液细胞的分析，包括物理原理（电阻抗、散射光、高频波/射频等）、化学原理（特异性溶血、普通颗粒染色、酶染色、核酸染色）。 在最新推出的SYSMEX XE-2100系列、XT-2000i/1800i系列五分类血液分析中，半导体激光作为光源将光束照射在流式细胞室内的白细胞，通过不同角度的散射光可以反映细胞外部的体积和内部颗粒复杂程度的信息（图1）。其中侧向信号用以反映细胞内部信息（主要是颗粒的复杂性）。试剂中增加了特异性针对DNA/RNA染色的荧光染料Polymethine(聚次甲基染料)。激光照射后产生荧光信号，和侧向散射光一道绘制成二维散点图进行白细胞分类。 b.幼稚白细胞分析的应用 白细胞中的幼稚成份在临床上具有显著意义。过去，此类标本主要依靠人工镜检。随着血液分析仪检测技术的发展，仪器对于幼稚白细胞的报警提示越来越灵敏。 通过一些特异性的化学手段，五分类仪器还可以进行幼稚白细胞的定量检测（图3）。SYSMEX XE/XT系列采用核酸荧光染色后，根据细胞成熟度的不同可 以体现在其荧光信号的强弱上，其白细胞分类通道出正常细胞分类外，还有两个幼稚白细胞的定量参数：IG（幼稚粒细胞）和Other（原始细胞/异常淋巴）。临床研究表明IG可以作为感染性疾病、白血病、炎症的有用参数，另外也提示治疗的预后和疗效监测。 2.在红细胞、血小板系分析的应用 a.光学染色法检测PLT 通过光学技术，可以在一定程度上改善电阻抗原理仅仅判断细胞体积所带来的局限性，提高了红细胞和血小板的准确性。而现代生物染色技术的发展，使更加特异性的核酸染色法与光学技术结合成为可能。在SYSMEX XE-2100、XT-2000i血液分析仪上，检测血小板的方法增添到两种。仪器的红细胞和血小板检测通道采用鞘流电阻原理，常规标本即以此为检测手段。当一些特殊标本混有大型血小板或小球性红细胞时，二者之中会有一部分具有相同的体积使电阻法无法准确区分，仪器还可以使用光学染色法检测(633nm波长的半导体激光束，染料为Plymethine和Oxazine)。血小板由于体积较小，但颗粒中存在有少量RNA，被染料轻微着色而激发出荧光，此时得到的血小板结果更加可信。（详见图4） b.网织红细胞分析 网织红细胞是晚幼红细胞脱核后与成熟红细胞之间的过渡细胞，是反映骨髓造血功能的重要指标。目前用自动分析仪进行网织红细胞分析的技术已经取得很大进展。 随着五分类仪器技术日臻发展，Sysmex XE-2100、XT-2000i具备了内置式的全自动网织红检测功能。采用激光流式原理和细胞核酸染色。除了进行自动的RET数目和百分比计数外，还可以通过核酸染色得到的荧光信号强度区分低、中、高荧光强度的网织红（LFR、MFR、HFR）。由于幼稚的网织红荧光信号较强，MFR和HFR之和即反映未成熟网织红的一个有用参数。 b.有核红细胞分析 有核红细胞作为幼稚的红细胞在治疗监测和鉴别诊断时有重要临床意义。而且，有核红细胞体积与淋巴细胞相仿或略小，大多数仪器对这样的标本往往会误计，这样不但漏报了病理标本，而且造成白细胞（淋巴细胞）结果假性升高。随着五分类仪器的出现，仪器报警系统开始可以提示其存在的可能性，供操作人员镜检复核。 真正采用染色手段来自动化地定量检测有核红细胞的功能，出现在SYSMEX XE-2100和XE-2100L上（图5）。XE-2100仪器单独设置检测有核红细胞的通道，特殊的溶血素将红细胞完全破坏，有核红细胞被裸核并收缩，而白细胞被保留。核酸荧光染色Polymethine对标本染色后，白细胞细胞核和胞质内核酸的染色总量远大于同样被染色但被收缩的有核红细胞，通过半导体激光照射后荧光信号和前向散射光信号均有区别。由此准确计得有核红细胞数目及占白细胞的比例。 三 小 结 在当今实验室五分类仪器逐渐普及的情况下，实验室对五分类仪器的要求也在逐渐提高。保证正常白细胞五项分类结果准确计数、全自动分析网织红细胞等已经成为实验室的基本需求。而为临床和实验室最为关注的幼稚白细胞、异常血小板、有核红细胞有效测定问题，则成为制造商、实验室用户关注的焦点。核酸荧光染色技术在血液分析仪应用以后，上述问题在SYSMEX的XE/XT系列五分类仪器上基本得到较好解决。 美国FDA于2001年12月4日制定了最终的指导纲要（第一个文件在2000年发布），题为：“二级特殊控制指导性文件：针对幼稚和异常细胞的全自动细胞计数分类装置上市前公告；给制造业和FDA的最终指导性纲要”。允许制造商开发并推广有临床实用意义的新参数，并要求经过严格的临床研究、数据处理和FDA认可。根据该指导纲要，SYSMEX开发并申请通过的参数有： 未成熟网织红参数（IRF） ——1997年8月通过FDA； 有核红细胞（NRBC）——1999年11月通过FDA； 造血祖细胞（HPC）——2002年4月通过FDA； 未成熟粒细胞（IG）——2003年9月通过FDA。 总之，核酸荧光染色的应用，即大大提高了幼稚、异常细胞成份的检出灵敏度，减少血常规检测漏诊，又可以精确定量地提高“扩展分类”参数，有利于临床疗效监测和鉴别诊断。