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杨胜科 张威 任远强
本文作者杨胜科先生，长安大学应用化学系副教授; 张威女士，讲师; 任远强先生，陕西开元生物科技有限责任公司工程师。
关键词: 血液分析仪配套试剂 血红蛋白 质控
经典的血细胞检查方法是借助于显微镜进行人工计数和分析，不仅费时费力，准确性也较差。20世纪50年代以后，出现了血细胞计数仪(Blood Cell Counter)，能够对经稀释后的血细胞进行计数。以后逐步改进和发展，不仅测量数据更可靠，测量参数也不断增加，自动化水平也有了很大提高。目前，国内外普遍使用自动血液分析仪(Automated Heamatology Analyzer)，大大提高了血常规工作效率。
一 血液分析仪的工作原理
1947年，美国人库尔特(Coulter)发明了粒子计数技术，它根据不导电颗粒经过阴阳电极间的充满电解质溶液的小孔时，会产生的瞬间电阻变化，来感知颗粒的大小和数量，称为电阻法原理，又称库尔特原理。50年代初应用于血细胞计数，依据血细胞非特异性的性质，对电解质溶液中悬浮颗粒(血细胞)在通过小孔时引起的电阻变化进行检测，现市售的血液分析仪基本都采用该原理设计。另一种方法是光散射测量法，同电阻抗法一样，全血标本首先按一定比例稀释成细胞悬液，在鞘液的作用下，形成细胞流，细胞被排列成单列快速通过光学检测区，当液流中的细胞与测定光束相交时，由于血细胞组成与鞘液不同，引起光散射变化，从不同角度检测散射光信号，可以获得与细胞体积结构有关的信息，以此来进行细胞计数及体积测定，一般在进行血细胞五分类测定时，光散射法与电阻法同时采用。
二 血液分析仪配套试剂的类型
血液分析仪在分析计数过程中采用库尔特原理，根据细胞在测试过程中产生的脉冲幅度与仪器设备的阀值比较而得出。作为全血其细胞数量达1012个/L之多，直接通过小孔计数难以将每个细胞所形成的脉冲信号区分开来，为此必须对全血进行稀释，以便于仪器计数，这就需要仪器使用最基本的试剂——稀释剂，以便对全血进行稀释。全血中白细胞数量约为109个/L，而红细胞计数达1012个/L，前者小于后者1000倍。如采用电阻抗法计数时，仪器只能识别有多少个颗粒，而无法识别哪个为红细胞，哪个为白细胞。为了进行血细胞计数与分类，仪器设计采用另一种试剂——溶血剂，它可以将红细胞溶解掉 (溶血作用)，再进行计数，就得出全血中白细胞数量。每份标本测定完毕之后，都要对仪器管道、小孔、计数池等进行清洗，以免相互干扰。所以仪器还要用到起清洗作用的试剂——清洗剂。有些仪器功能较强，对白细胞还可进行五分类，此时还用到了鞘液、保护液等试剂。
三 配套试剂的作用
根据稀释剂在使用过程中所起的作用，要求其是具有酸碱缓冲作用，适当的离子强度和电导率的等渗液。适当的离子强度和与血浆相同的渗透压能在一定时间内完整地保持血细胞原来的体积; 而合适的电导率能保证获得与细胞体积，相应的脉冲大小; 溶血剂则是一类强的表面活性剂，它的作用一方面是溶解红细胞，进行白细胞分类与计数，另一个作用是溶解红细胞，释放出血红蛋白(HGB)，形成稳定的血红蛋白衍生物，进行血红蛋白的测定。不同种类的溶血剂对白细胞形状、大小影响不同，如十六烷基三甲基溴化铵能使白细胞膜皱缩，胞体缩小，而皂素能使白细胞体积增大。同一种溶血剂浓度高低不同，对白细胞体积影响也不同，通常是随着溶血剂浓度增高，白细胞体积缩小，测量时脉冲也变小。随着溶血剂的用量增加或溶血时间的延长，白细胞破裂，皱缩在细胞核周围的胞浆颗粒及胞膜脱落，而仅剩细胞核。清洗剂则主要是清洗管道，避免标本之间污染。
四 血液分析仪配套试剂
质量要求
血液分析仪配套试剂尽管与原装试剂在成份与剂量上不同，但对同一份血液所产生的脉冲信号应该相同，白细胞分类直方图应该重合，细胞分类结果应一致，在红细胞、血小板测定体系中，细胞数MCV、MPV等参数在两种试剂中所得结果应是相同的，空白计数符合仪器标准，溶血剂溶解血细胞的速度、程度应相同，血红蛋白与溶血剂作用后生成的血红蛋白衍生物的吸收光谱与氰化高铁血红蛋白法(HICN)应相似，吸收峰最好在540nm。配套试剂成份不应损坏机器的部件或影响使用寿命。
对稀释剂应符合下列基本要求:
(1) 稀释剂应清亮透明，不得有沉淀、絮状物。
(2) 对被检测的细胞无有害影响，能在数小时内完善地保存细胞原来体积。
(3) 有适当的电导率，在微孔内外电极间电阻最好为10~20kΩ。
(4) 必须是等渗溶液。
(5) pH值接近中性。
(6) 空白计数符合仪器要求，通常为:
RBC≤0.05×1012/L WBC≤0.3×109/L HGB≤2g/L PLT≤10×109/L
对溶血剂除满足清亮透明等物理特性外，还要求:
(1) 能迅速溶解红细胞膜，释放出血红蛋白，保证溶解的红细胞膜碎片<2fL(1fL=10-15L)。
(2) 能迅速释放出血红蛋白，并转化成稳定的血红蛋白衍生物。
(3) 与稀释剂相互配合保持白细胞完整，将其胞浆内的颗粒及细胞膜本身皱缩在细胞核周围，便于仪器进行分类与计数。
清洗剂根据不同厂家仪器又可分为冲洗液(Detergent)和清洁液(Cleaner)。冲洗液应具有:
(1) 足够的湿润作用，以便迅速地从整个流量系统中赶走气泡。
(2) 能在每个测量管内提供合适的弯月面，并保持到测试完成。
(3) 在血红蛋白测定时，能提供合适的零点参考。
对清洁液的要求:
能有效地清除管道内污物，保持管道系统清洁，不使管道腐蚀变色。
五 配套试剂的质量控制
血液分析仪配套试剂做为一种新型产品，其试剂质量的高低、质量的控制等问题成为研制者、使用者都十分关注的问题。所幸国家药品监督管理局北京医疗器械质量监督检测中心等单位共同提出了血液分析仪用试剂的行业标准 (草稿)，该标准对配套试剂从外观和性状、外部标识、净含量、pH值、空白计数、电导率值、渗透压等指标给出具体要求，这无疑对控制试剂质量提供参考依据。但是，值得探讨的是，由于不同系列试剂的化学成分之间差别较大，行业标准所规定的指标只给出了一个范围，如稀释液的电导率值应符合标准值±0.5mS/cm。标准值要根据适用仪器的设计要求给出，但应保持在12.00~ 17.00mS/cm的范围内(20±1℃)，有些指标的控制效果与试剂质量之间的相互关系尚需进一步探讨。
六 国外试剂生产情况
血液分析仪配套试剂之所以叫配套试剂，是因为必须与仪器配套使用而得名的。因此，在国外一般生产仪器的厂家都推出与自己仪器相配套的试剂，例如: 美国Backman-Coulter公司只生产适用于T系列(二分类系列)、JT、MD、Onyx(三分类系列)以及MAXM、STKS (五分类系列)的试剂; 美国Abbott公司生产适用于Cell-DYN 610、1300、1400、1500、1600、1700(二分类、三分类)试剂和CD 3000、3200、3500、3700 (五分类)试剂; 日本东亚(TOA)公司生产适用于F系列(800、820二分类)、K系列(K1000、K4500系列)、KX-21(三分类)试剂以及NE(1500、8000)、SF3000、SE-9000、R-1000、R-3000、HST301(五分类)试剂。以上三家公司是世界著名的血液分析仪与配套试剂生产公司，除此而外，还有德国拜耳(Bayer)公司生产的Technicon H系列(H1、H2、H3)五分类试剂，拜耳公司目前主推仪器及试剂是五分类的高档机型。瑞典Swalab公司主要针对AC系列(AC900、920、970以及920E01三分类)仪器推出配套试剂。日本光电Celltac公司生产MEK系列仪器及试剂，分别适用于三分类(MEK 6108)和五分类(MEK 8108)，法国莉莎(HYCEL GROUPE LISABIO)公司推出HEMACELL系列仪器及配套试剂，瑞士罗氏(Roche)公司与法国ABX公司合作生产COBAS MOCROST系列——MINOS(三分类)、AELIOS、ARGOS、VEGA(五分类系列)仪器及配套试剂。一般而言，血液分析仪性能改进从两方面进行，一是对仪器硬件、软件性能改进，改进后试剂仍沿用过去的，一般不发生变化，如Coulter公司将JT机型升级到JT-IR; Sysmex公司将K1000升级到K4500; Abbott公司将CD1400升级到CD1700，试剂仍通用。第二种改进是引入新的原理，此时，试剂可能就要发生变化或引入新的试剂，例如Coulter公司JT三分类血液分析仪使用试剂有稀释剂、溶血剂和清洗剂，在此基础上，采用了容量电导光散射法(Volume Conductivity Light Scatter，VCS)以后，测定功能由原来三分类升级到五分类，试剂也在原有三种的基础上再增加两个，分别是鞘液和保护液。
过去，血液分析对Hb的测定均采用了氰化血红蛋白法，所以试剂都含有氰化钾，对使用者的健康及环境构成威胁。20世纪90年代，TOA公司将SLS测定血红蛋白法应用于血液分析仪，避免了氰化钾对人体的危害，由于SLS为阴离子表面活性剂，而DTMAC为阳离子表面活性剂，因而对白细胞和Hb的测定要分管路进行，从而造成诸多使用上的不便和麻烦。这一新技术产品的推出，促进了其他生产厂家的技术改进，出现了新的测定方法，如细胞化学法与激光技术等。
七 国内试剂的开发情况
我国血液分析仪配套试剂的研制始于20世纪80年代，王诩淑首次报道了Bayer 700型血液分析仪使用的试剂，以后不断有学者对二分类或不分类溶血剂研制报道，1995年彭毅对国内血液分析仪用溶血剂的研制进行评价，指出配套试剂的研究应向三分类试剂发展。之后，刘东海报道了适用于Coulter JT三分类仪器的配套试剂。过复康针对CD 1600三分类血液分析仪进行试剂研制，丛玉隆教授相继推出数种机型的配套试剂，并推广使用。与此同时，陕西开元生物公司、南昌百特实业公司、烟台卓越科技有限公司等厂家也相继推出适用于二分类和三分类的血液分析仪配套试剂，结束了国内无血液分析仪配套试剂生产厂家的历史，使试剂生产实现了国产化。
目前国内正处在完善三分类血液分析仪配套试剂品种和质量，努力开发五分类等高档试剂的阶段，如开元生物公司、百特实业公司等除已拥有了CD、Coulter、AC、BT、HC、CA、KX-21等系列三分类试剂之外。陕西开元生物公司等单位正在积极推出Coulter STAX、Sysmex SF 3000等五分类试剂。
八 国内试剂研发展望
回顾我国血液分析仪配套试剂的发展历程，我国试剂的研发工作较国外尚有一定差距，为了使配套试剂在质量上有一个飞跃，全面达到国际先进水平，尚须从以下几方面努力工作。
1. 尽快研究建立并完善试剂质量控制体系。
2. 积极研发适用于配套试剂及仪器的质控物和校准物，以保证测定结果的准确性和精确度。
3. 随着我国血液分析技术水平的不断提高，既可以进行白细胞五分类计数，又避免了剧毒物品对人体及环境危害的五分类试剂将成为试剂研发的方向。
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