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（二）底物显色法（生物化学法）
底物显色法（图7）通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的，该方法又可称为生物化学法。检测通道由一个卤素灯为检测光源，波长一般为405nm。探测器与光源呈直线，与比色计相仿。
凝血仪使用产色底物检测血栓与止血指标的原理是：通过人工合成与天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序并还有特定作用位点的小肽,并将可水解产色的化学基因与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白不解酶的活性，它不仅作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基因，使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系，故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种，而最常用的是对硝基苯胺（PNA），呈黄色，可用405mm波长进行测定。
底物显色法灵敏度高、精密度好，而且易于自动化，为血栓/止血检测开辟了新途径。
底物显色法通常使用以下三种形式：
a) 先将被检血浆中的某种酶加以激活，然后由此活化的凝血因子对人工合成的底物进行水解而呈色，如纤溶酶原，蛋白C测定等。
b) 向被检血浆中加入过量的有关试剂，以中和相应的抗凝因子，然后测定其残余的酶活性，如AT-活性测定，α2-抗纤溶酶测定，肝素测定等。
以测定抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)为例，在反应体系中加入过量的凝血酶，后者与血浆中的AT-Ⅲ形成1：1复合物，剩余凝血酶作用于合成的凝血酶底物S-2238（H-D-Phe-Pip-Arg-PNA·2Hcl），释放出显色基团PNA，显色反应的深浅与剩余凝血酶的量呈正相关，而与AT-Ⅲ的活性呈负相关。
c) 直接测定被检血浆中某种蛋白水解酶的活性，如凝血酶，Xa，尿激酶测定等。
（三）免疫学方法
在免疫学方法中以纯化的被检物质为抗原，制备相应的抗体，然后用抗原抗体反应对被检物进行定性和定量测定。常用方法有：
1．免疫扩散法 将被检物与相应抗体在一定的介质中结合，测定其沉淀环的大小，与标准进行比较，计算待测物的浓度。此法操作简单，不需特殊设备，但耗时过长，且灵敏度不高，仅适于含量较高的凝血因子的检测。
2． 火箭电泳 在一定电场中，凝胶支持物内的被检测与其相应抗体结合形成的一个个“火箭峰”，火箭峰的高度与其含量成正比，通过测定峰高并与标准比较而进行定量测定。此法操作复杂，临床应用较少。
3．双向免疫电泳 通过水平与垂直两个方向进行电泳可将某些分子结构异常的凝血因子进行分离。
4. 酶联免疫吸附试验（ELISA法）用酶标抗原或抗体和被检物进行抗原结合反应，经过洗涤除去未结合的抗原或抗体及标本中的干扰物质，留下固定在管壁的抗原抗体复合物，然后加入酶的底物和色原性物质，反应产生有色物质，用酶标仪进行测定，颜色的深浅与被检物浓度呈比例关系。该法灵敏度高，特异强，目前已用于许多止血、血栓成分的检测。
5．免疫比浊法 将被检物与其相应抗体混合形成复合物，从而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比浊或散射比浊进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。
免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。
直接浊度分析既可通过透射比浊，也可通过散射比浊。
透射比浊是指凝血仪光源的光线通过待检样本时，由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗体复合物，使透过的光强度减弱，其减弱程度与抗原量成一定的数量关系，通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。
散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时，由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物，使溶质颗粒增大，光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系，通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。
另一种是乳胶比浊法，即将将待检物质相对应的抗体包被在直径为15～60nm的乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集，体积增大，使透射光和散射光的变化更为显著，从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前，多用于FDP和D-二聚体的检测。
第三节 血凝仪的基本结构
血凝仪按自动化程度可分为半自动化及全自动化，前者主要检测一般常规凝血项目，后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能，除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能进行全面的检测，尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室监测。
（一） 半自动血凝仪
目前市售的半自动血凝仪主要由样品、试剂预温槽、加样器、检测系统（光学、磁场）及微机组成。有的半自动仪器还配备了发色检测通道，使该类仪器同时具备了检测抗凝及纤维蛋白溶解系统活性的功能。
针对光学式半自动血凝仪受人为的因素影响多、重复性较差等缺陷，仪器中应有自动计时装置，以告知预温时间和最佳试剂添加时间；在测试位添加了试剂感应器，后者感应从移液器针头滴下的试剂后自动振动，使反应过程中血浆与试剂得以很好地混合；此外，该类仪器在测试杯顶部安装了移液器导板，在添加试剂时由导板来固定移液器针头，从而保证了每次均可以在固定的最佳的角度添加试剂并可以防止气泡产生。这一系列改进，提高了光学式半自动血凝仪检测的准确性。
一般半自动血凝仪都可进行凝固法测试，而需要用其它测试方法实现的凝血项目则可用生化分析仪、酶标仪等进行。
（二） 全自动血凝仪
该类仪器的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。图8为一台全自动血凝仪的实例。
1. 样品传送及处理装置 一般血浆样品由传送装置依此向吸样针位置移动，多数仪器还设置了急诊位置，可以使常规标本检测必要时暂停以服从免疫比浊法 将被检物与其相应抗体混合形成复合物，而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比法或散射比浊进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。
免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。
直接浊度分析既可通过透射比浊，也可通过散射比浊。
透射击比浊法是指凝血仪光源的光线通过待检样本时，由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗菌素体复合物，使透过的光强度减弱，其减弱程度与抗原量成一定的数量关系，通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。
散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时，由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物，使溶质颗粒增大，光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系，通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。
另一种是乳胶比浊法，即将待检物质相对应的抗体包被在直径为15~60nm的乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集团，体积增大，使透射光和散射光的变化更为显著，从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前，多用于FDP和D-二聚体的检测。
急诊标本的优先测定。样品处理装置由标本预温盘及吸样针构成，前者可以放置几十份血浆样品。吸样针将血浆标本吸取后放于预温盘的测试杯中，可供重复测试，自动再稀释和连锁测试之用。
2. 试剂冷藏位 为避免试剂的变质，仪器往往有试剂冷藏功能，一般同时可以放置几十种试剂进行冷藏。
3. 样品及试剂分配系统 样品臂会自动提起标本盘中的测试杯，将其置于样品预温槽中进行预温。然后试剂臂将试剂注入测试杯中（性能优越的全自动血凝仪为避免凝血酶对其他检测试剂的污染，有独立的凝血酶吸样针），带有旋涡混合器的装置将试剂与样品进行充分混合后将送至测试位，经检测的测试杯被该装置自动丢弃于特设的废物箱中。
4．检测系统 这是涉及仪器测量原理的关键部分。检测血浆的凝固可以通过凝固反应检测法检测，即当纤维蛋白凝块形成时，检测散射光在660nm处浑浊液吸光度的变化；或通过凝固点检测法检测，即计算达到预先设定好的吸光度值时的凝固时间；而磁珠法则是通过测定在一定磁场强度下小钢珠的摆动幅度变化来测定血浆凝固点。发色底物法及免疫法是检测反应液在405nm、575nm及800nm时的吸光度变化来反映被检测物质的活性。
5. 电子计算机 根据设定的程序计算机指挥血凝仪进行工作并将检测得到的数据进行分析处理，最终得到测试结果。计算机尚可对患者的检验结果进行储存，记忆操作过程中的各种失误，及进行质量有关的工作。
6. 输出设备 通过计算机屏幕或打印机输出测试结果。
7. 附件 主要有系统附件、穿盖系统、条码扫描仪、阳性样品分析扫描仪等。
现代全自动血凝仪有以下一些性能特点，使它在临床应用中日益受到欢迎：
a） 测速度快、检测项目齐全 目前广泛使用的的检测速度多在50～300测试/小时，较快的可达700测试/小时；检测的项目除常规的凝血筛选实验外，可进行单个凝血抗凝、纤溶系统因子的检测，也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。
b） 活性与抗原性同时检测 目前有的全自动血凝仪除了利用血浆凝固法和显色底物法进行有关因子活性检测外，尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。
c） 检测通道、同时检测项目 性能优越的血凝仪有 多个检测通道，同时检测的项目可以多达10个。
d） 标本及试剂位 全自动血凝仪一般有超过50个标本位，有的尚设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的血凝仪设有几十个15℃的试剂位，可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机，有的仪器检测时可以不打开样品管，从而使检测的自动化又有提高。
e） 平行线生物学分析功能 有的血凝仪可以进行全自动多浓度稀释分析，根据与标准曲线呈平行状态的平行线图象来显示不同稀释浓度的测试结果。
f） 自动重检、连锁功能 当检测结果异常时，有的全自动血凝仪可以根据先前的设定，自动对样品进行稀释重检或不稀释重检，并进行自动连锁筛选实验。如当APTT检测结果异常时，仪器可以自动进行重检，结果如仍然异常，血凝仪自动进行PT测定，若结果正常，根据设定，仪器可以自动检测FⅧ： C、FIX：C、FXI：C或FⅫ：C；若PT的结果亦为异常，仪器可以自动检测Fib的含量。
g） 质量控制 有些全自动血凝仪拥有10组各2个质控文件，1个为现用质控文件，另一个是新批号质控文件，以全面支持实验室质控要求。在均数或L-J之外，有的全自动血凝仪还另外附加了一种新型的多规则质控方法（Westgard），从而为检验提供具有高可靠性的测试结果。
h） 结果的储存、传递 计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存，通过特定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。
i） 科研通道 目前较高级的血凝仪均为用户设计了科研通道，使其应用范围得以扩大。
j） 开放的试剂系统 根据我国的国情，许多仪器厂商在血凝仪上设置了开放的试剂检测系统，以使用户可以灵活选用不同试剂进行检测。
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