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色谱分析技术

高压液相色谱

Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展，高效液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱（HighSpeed Liquid Chromatography），高压液相色谱（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名称是高效液相色谱（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶重复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。

一、分类

　　高效液相色谱法可分为四个基本类型：即液－固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体积排阻色谱法。
（一）液－固色谱法
　　液－固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液－固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的，在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用，这些区域为活性位置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长。在液－固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置， 从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，因而称强溶剂，反之为弱溶剂。液─固色谱法的特点是适于分离色谱几何异构体，可用于脂溶性化合物质如磷脂，甾体化合物，脂溶性维生素，前列腺素等。
（二）键合相色谱法
　　键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。
1.正常相色谱法
　　在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液－固色谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此，正常相色谱法的分离原理主要根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离，它不适于分离几何异构体。
2.反相色谱法
　　在反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链碳氢化合物，如正辛基等。流动相的极性比固定相的极性强。反相色谱法在高效液相色谱法中应用最广泛。 在反相色谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。所谓疏水作用即当水中存在非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用 、溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用， 因此溶质分子从水中被“挤”了出去。可见反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，在色谱柱中滞留时间也长，所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物，亦即非极性基团的化合物。此外，反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH，以影响溶质分子与流动相的相互作用，改变它们的滞留行为。另外，反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大，可以／从0-100％，从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和和烷烃，其链的长短不同，最长的是十八烷基，这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加，在反相色谱柱中溶质由于疏水作用而滞留的时间也将随着碳氢链的长度而增加。在一般情况下这意味着用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率，在多数情况下是依靠反复来选择色谱柱。由于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物，溶质与固定相之间的作用主要是非极性相互作用，或者说疏水相互作用，因此溶剂的强度随着极性降低而增加。水是极性最强的溶剂，也是反相色谱中最弱的溶剂。在反相色谱中常常用和基础溶剂，向其中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。
在生化分析中，反相色谱的应用极广。可用于①氨基酸和多肽的分析；②蛋白质的分离；③碱基，核酸和核酸酶的分析；④甾体化合物的分析；⑤以及其他如几茶酚胺类，组胺，糖及维生素的分离。
（三）离子交换色谱
　　离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH₂，及－MH³⁺ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO₃H及－COOH。其中-NH³⁺离子交换柱及-SO₃H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH₂及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。

二、易出现的问题

（一）涡流扩散（Eddy diffusion）
　　流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
（二）分子扩散（Molecular diffusion）
　　分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
（三）质量转移（Mass transfer）
　　被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。
（四）动相流速
　　当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱效率。
（五）固定相颗粒大小
　　定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。

亲和色谱法

一、基本理论

（一）原理：在生物体内，许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。 2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。

（二）应用范围亲和色谱可用于下列生物体系：酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。

（三）载体的选择原则用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。选择也的配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。

（四）常见载体的特性琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。 纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。

二、实验方法　　亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下： 1选择配基；2选择偶联凝胶；3偶联配基；4装填合适的柱；5平衡（2-3倍体积缓冲液）；6应用样品；7洗涤未结合物质；8洗脱结合物质→除盐；9再生　　

吸附色谱法

吸附色谱法常叫做液－固色谱法（Liquid-Solid Chromatography，简称LSC），它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，例如硅胶、氧化铝和活性炭等。活性点位例如硅胶的表面硅烷醇，一般与待分离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部分（例如烃）对分离只有较小影响，所以液－固色谱法十分适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。