[转发]分子生物学标准化现状

分子生物学标准化现状

吕 虹 首都医科大学附属北京天坛医院 　　基因技术可给人类巨大的利益，但也给医学、伦理、法律和经济带来巨大冲击。基因检验滥用造成了资源浪费及不必要的医疗纠纷，基因隐私导致用人和保险歧视，但限制基因检验又对基因检验技术的发展造成负面影响。 　　美国卫生部(DHHS)为解决对基因检验安全和有效性的评估及了解有无必要进行更多的监督和管理。于1998年成立SACGT (Secretary’s Advisory Committee on Genetic Testing)。由13名来自基因学、法律、产业、消费保护者等非政府专家和6名DHHS各部门无投票权官员组成。任务是对上述各项事务进行分析，征求公众对监督措施有效性的意见，对DHHS提出建议。SACGT从1999年12月到2000年1月公开征求意见，共发出2500封信给个人和团体。2000年3月15日公布给DHHS的建议，内容有：以分子基因和细胞基因检验定义为临床目的，分析人类DNA、RNA和染色体以查出和遗传病、后天获得病有关的基因型、变异、表型或者染色质组型。目的还包括预警疾病，识别携带者，建立个体、家族或者人群的产前诊断或预后判断等。 　　临床基因扩增实验室近年来在我国发展很快，基因诊断技术在疾病的预防、诊断、治疗方面起到了积极的作用。由于基因扩增检测技术的应用对实验室的环境条件、仪器设备、试剂耗材、人员技术能力和质量控制等方面要求严格，而一些实验人员对此不甚了解，加之利益的驱使，曾经在20世纪80年代，某些沿海省份的实验室未按要求规范设置，出现气溶胶污染，导致大规模假阳性结果报出，为临床诊断造成了极大的困难。为了规范实验室，保证基因扩增技术有效应用，防止假阴性、假阳性结果的报出，为临床出具合格而可靠的报告，规范临床基因扩增实验室是必然而且也是必要的。卫生部2002年1月14日发布了卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，同年2月20日卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的条件：(1)二级以上医院实验室，经卫生部临床检验中心验收合格；(2)从事基因扩增实验操作的人员必须经过培训并取得上岗证；(3)使用经国家药品监督管理局批准的允许进入市场销售的商品试剂盒；(4)开展卫生部允许开展的项目。具备了以上几条后，我们从事临床基因检测任务才是符合要求和规定并对临床出具的报告有保障。 　　在基因扩增时最常遇到的一个问题就是假阴性和假阳性的问题，在解决这些问题时我们应采取如下措施： 　　1. 标准化环境 　　在基因扩增时，污染是一个比较严重的问题，解决污染问题应该建立一套严格的防污染措施。首先要解决的就是环境问题，PCR对环境要求严格，其检测的不同步骤应在不同的房间进行，试剂准备区、样本提取区和产物扩增及分析区应严格划分，各个房间中的物品不能混用，包括加样枪、纸、笔以及清洁用品等，工作流程也应是单向的。在标准的环境下才能得到可靠的实验数据，避免假阳性的出现。

2. 人员管理
　　有人为因素造成假阳性和假阴性的结果是不可完全避免的，只能使其缩小到最小程度。对人员的要求应有一下几点：具有较高的素质；经过指定地点的培训，能顺利的通过国家设立的定期考核；对PCR的原理、可应用范围、PCR的局限性及发生污染的每一个环节有充分的了解；熟悉PCR的操作规程。具备以上几点的人员需持证上岗并具有较强的责任心。并定期加强理论及实际操作知识的训练，增强责任心，善于分析试验结果，尽可能小的避免假阴性和假阳性的出现。
　　3. 建立规范的实验室标准操作程序
　　标准化操作程序的制定和执行是实验室实现标准化管理的一个关键，一切试验操作均应标准化，才能降低假阴性和假阳性的可能。
　　很多情况都会引起结果的偏差，非特异性扩增引起的假阳性可用特异的探针来鉴别或用其他方法来检测。气溶胶的污染造成移液器的污染是很严重的问题，用带滤芯的吸头可以几乎避免这一情况发生。同时在进行样本检测时设立阴性对照、试剂空白对照和阳性对照是尤为重要的。目前，各试剂厂家的均引入了UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶），使预防污染的工作有了突破性的进展。技术上的问题假阴性可以通过设立阳性对照来解决。对于模板含量低造成假阴性结果只能提高样本制备的水平。要想解决抑制因素存在问题，最可靠的方法就是设立内对照来监控每个PCR的过程。
　　4. 标准化试剂盒
　　分子生物学标准化还体现在试剂盒的质检上，一个试剂盒的质量直接关系到检测结果的准确性程度。PCR的试剂盒组成包括核酸提取试剂、核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂、产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）。影响PCR试剂盒质量的因素包括内在因素和外在因素，内在因素包括原材料（寡核苷酸引物和探针、缓冲液和dNTP、聚合酶、逆转录酶等）、核酸提取方法、方法学设计。外在因素包括试剂盒的运输和贮存。

　　为了进一步规范临床分子生物学实验室，卫生部临检中心指导实验室的规范化，除了推进上岗人员的培训，还建立了认可体系，开展了认可活动，至今已有二百余家实验室接受认可，从不同角度在提高水平，加强规范上无疑是必不可少的一个过程。
　　总之，应对扩增技术实施标准化和适当的质量控制程序，才能保证其用于常规检测中的准确性和可靠性。