[转发]尿中免疫化学非反应性白蛋白

尿中免疫化学非反应性白蛋白

――对试验诊断和临床化学家的挑战 王金良 天津市公安医院检验科　300050 　　 　　糖尿病患者尿中的微量白蛋白（mAb）的检测对早期发现糖尿病肾病的意义已为临床所广泛重视。近期发现糖尿病（可能也包括心血管病，高血压）患者尿中的一部分白蛋白用常规的免疫化学检测手段（RIA,免疫浊度法，免疫光散射法）不能检出，且在尿中出现得比mAb早数年。这种蛋白暂且被命名为免疫化学非反应性白蛋白（Immunochemically Nonreactive Urinary Albumin,INUA）。 　　尿中的白蛋白可存在多种形式。2001年Greive等[1]发现患糖尿病鼠的尿中白蛋白量增高，但用常规的免疫化学法测定不出。Couper等[2]用高效液相层析法（HPLC）来测定糖尿病患者尿中的白蛋白证实了尿中存在着用免疫化学法不能测定的白蛋白。他们进一步发现，如用HPLC法来检测总白蛋白，可提前3.9年预示1型糖尿病患者发生了持续性白蛋白尿，2型糖尿病可提前2.4年[3]。 Brikman等[4]在外周血管病患者也发现此种现象。于是，对INUA的研究引起极大的关注。现简要介绍其进展情况： 　　 　　一、正常的尿中白蛋白排泄 　　健康者的双肾每分钟有约650ml血浆流过，即每天约有37000g血浆白蛋白流经肾小球，其中只有1.3g会经肾小球漏出，约只占0.004%，而这1.3g白蛋白中仅有约1%，即15mg会出现在尿中，但常规的蛋白定性为阴性，只有用极敏感的测定方法才能检出。其余的白蛋白经近曲肾小管处理，被摄入近曲肾小管细胞的内质网与溶酶体融合。在溶酶体酶，cathepsin B和D以及胱氨酸蛋白酶的作用将分子量为66500 kDa的白蛋白降解为500-15000kDa的碎片。 　　经用人工培养的人近曲肾小管细胞（HK-2细胞）和同位素标记的白蛋白研究发现，1.3克自肾小球滤出的白蛋白绝大部分回收入血。尿中最多只出现18%，这部分尿中排出的白蛋白已有结构上的改变，故不能用免疫化学测定方法测得。用Western印迹法可以发现。因此，实验室能测得的健康者尿中白蛋白不超过15mg/d。 　　 　　二、INUA存在于早期糖尿病肾病患者尿中的证据 　　Osika等同时用3种方法检查尿中白蛋白：RIA,HPLC法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）。结果表明，对无糖尿病的健康者，三法的一致性良好。8名有轻型肾损伤的糖尿病患者，HPLC法均高于RIA法，前者的平均浓度为44.6mg/L，后者的平均浓度为18mg/L。其中4例患者用RIA法测定低于25mg/L，而用HPLC法为高于41mg/L，即约有半数患者用RIA法测定为正常者，实际上已有早期肾损伤发生。他们同样对97名糖尿病患者进行检查，33%的结果用RIA法为正常浓度，而用HPLC法为异常。85名健康对照组中只有3.5%的尿白蛋白超过正常）。HPLC法与PAGE法的相关性良好（r2=0.83），因为它们均可检测全部的白蛋白，而不仅是免疫反应性白蛋白。HPLC法与SDS-PAGE法的相关性较差（r2=0.65）,而与RIA法的相关性好（r2=0.84），因为在SDS-PAGE时白蛋白不稳定，会降解为碎片。Osika等[5]已用亲合层析和纯化技术自糖尿病患者尿中分离出分子量为66500Da的INUA,它的HPLC和PAGE性状与白蛋白完全一致，当用SDS-PAGE分析发现他们是白蛋白的改变形式，即是受到损伤的完整的白蛋白分子，其受损伤的原因是经过了肾小管细胞溶酶体酶的处理，但白蛋白分子仍由17个二硫键连成一体。当然，在SDS-PAGE过程中会裂解而分离。此种受损伤的白蛋白用RIA法和免疫浊度法检测不到。

三、INUA是否为其他种蛋白质？
　　经分离纯化的INUA用ELISA法定量其中可能有的其他尿蛋白，分别测定了IgG，转铁蛋白，α1酸性糖蛋白，α1抗胰蛋白酶，Na/K-ATP酶的β亚单位，结果均为阴性，这些蛋白的总量也不超过INUA的1%，可能来源于极少量的污染。有研究提出，脯乳动物尿中最丰富的蛋白是Tamm-Horsfall蛋白^[6]，但在纯化的INUA中用毛细管电泳和PAGE均未发现。

　　
　　四、NUA对糖尿病肾病的意义
　　众所周知，糖尿病的早期肾损伤主要是肾细胞溶酶体降解白蛋白和其他蛋白的功能减低。在早期肾小球滤过功能失常还不明显，随着肾小球损伤的加重而滤膜的孔径加大，滤过更多的蛋白，可出现大分子的IgG，IgM等，此时的溶酶体降解功能不良更加明显，导致更多的完整但受损伤的白蛋白分子出现在尿中，其分子构型有了改变^[7]，故免疫检测法的抗体不能与之结合而不能检出，但用免疫印迹法可以发现。所以，实验室能测得的健康者的尿液中的白蛋白不超过15mg/d。但糖尿病患者尿中的INUA可占到18%，且出现在尿微量白蛋白之前2-4年。有研究认为糖尿病患者血中经常升高的葡萄糖和脂肪酸也会引起白蛋白构型的改变，其确切的机制仍在研究中^[8]。检测尿中INUA对高血压患者^[9]，心血管病患者早期肾损伤的发现也有重要意义^[10]。


　　五、正确地检测INUA是对实验诊断学和临床化学家的挑战
　　HPLC法可检出全部完整的和经过酶处理而损伤的白蛋白，但在临床难以推广应用。有希望的方法是用毛细管电泳或改进的琼脂糖电泳或凝胶薄层电泳，但难适用于批量检查。Osika等已分离纯化出INUA,如能针对其独特的表位研制出单克隆抗体，又与正常的白蛋白无交叉反应，可发展出免疫标记法用于INUA的检测。这无疑是对临床化学和实验诊断学家的挑战。


参考文献
1．Greive KA, Eppel GA, Reeve S, et al.Immuno-unreactive albumin excretion increases in streptozotocin diabetic rats. Am J Kidney Dis, 2001,38:144-152.
2．Comper WD, Osika TM, Jerums G.High prevalence of immuno-unreactive intact albumin in the urine of diabetic patients. Am J kidney Dis, 2003,41:336-342.
3．Comper WD, Osika TM, Clark M et al.Earlier detection of microalbuminuria in diabetic patients using a new urinary albumin assay.Kidney Int 2004,65:1850-1855.
4．Brinkman JW, Bakker SJ, Gansevoort RT et al. Which method for quantifying urinary albumin excretion gives what outcome? A comparision of immunonephelometry with HPLC Kidney Int Suppl 2004,92:s69-75.
5．Osika TM, Comper WD. Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin. Clin Chem 2004,50:2286-2291.
6．Peters T Jr, New form of urinary albumin in early diabetes. Clin Chem 2004,50:2238-2239

7．Burne MJ, Panagiotopoulos S, Jerums G et al. Alterations in the renal degradation of albumin in early experimental diabetes Clin Sci 1998,95:67-72.
8．Osika TM, Houlihan CA, Chan JG, et al. Albuminuria in patients with type 1 diabetes is directly linked to changes in the lysosome-mediated degradation of albumin during renal passage Diabetes 2000,49:1579-1584.
9．Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE) study investigation. Effect of ramipril on cardiovascular and microvascular outcome in people with diabetes mellitus:results of the HOPE study and MICRO-HOPE substudy. Lancet, 2000,355:253-259.
10．Mogensen CE, Microalbuminuria and hypertension with focus on type 1 and type 2 diabetes J Intrn Med, 2003,254:45-66.